山东大学实验报告 2017年 11月6日
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科 目：微生物学实验 题 目： 霉菌的培养及形态观察 姓 名：丁志康 一、 目的要求
1.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。 2.了解四类常见霉菌的基本形态特征。
二、 基本原理
霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约为3-10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有下列三种：
1. 直接制片观察法：是将培养物置于乳酸石碳酸棉蓝染色液中， 制成霉菌制片镜检。用此染色制成的霉菌制片的特点是：细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥，能保持较长时间；能防止孢子飞散；染色的蓝色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。
2．载玻片培养观察法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌就在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期培养物。
3．玻璃纸培养观察法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在琼脂平板表面，然后将霉菌接种于玻璃纸上，经培养，霉菌在玻璃纸上生长形成菌苔。观察时，揭下玻璃纸，固定在载玻片上直接镜检。这种方法既能保持霉菌的自然生长状态，也便于观察不同生长期的形态特征。 本次试验使用的是第二种方法，即载玻片培养观察法。
三、 器材
1、菌种：曲霉，青霉，根霉和毛霉培养2-5d的马铃薯斜面培养物。 2、培养基：土豆琼脂培养基。 3、溶液或试剂：蒸馏水。
4、仪器或其他用具：无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U形玻棒，解剖针，解剖刀，镊子，95%乙醇以及显微镜等。
四、 操作步骤
（1）、培养小室的灭菌：在平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖、包扎后于121℃灭菌30min，烘干备用。 （2）、琼脂块的制作：取已灭菌的马铃薯琼脂培养基6～7mL注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1cm2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上（每片放两块，如右图）。 （3）、接种：用尖细的接种针挑取少量的孢子接种于琼脂块边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。（接种量要少，尽可能将分散的孢子接种在琼脂块边
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. 缘上，否则培养后菌丝过于稠密影响观察。） （4）、培养：先在平皿的滤纸上加10mL左右灭菌的纯净水（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖，28℃培养。 （5）、镜检：根据需要可以在不同的培养时间内取出载玻片置于低倍镜下观察，必要时换高倍镜。
五、 实验结果 1.实验照片
毛霉（10×10，示繁殖菌丝及孢子囊） 根霉（10×10，示孢子囊及假根）
青霉（10×40，示分生孢子） 黑曲霉（10×10，示足细胞及孢子囊）
六、 思考题
（1）你主要根据那些形态特征来区分上述四种霉菌？
①菌丝：毛霉与根霉菌丝无隔，而青霉与黑曲霉的菌丝有隔。
②菌落：毛霉的菌落气生菌丝极发达，延伸范围大，菌丝蓬松，颜色相对较白；根霉的菌落气生菌丝也很发达，但较毛霉少，菌丝灰色或褐色，在菌落表面有时能看到黑色小点；青霉的菌落相对较小，气生菌丝不发达，颜色呈青绿色，边缘青白色；黑曲霉的菌落也相对较小，气生菌丝不发达，颜色呈黑褐色或棕褐色。
③菌种特征：青霉的孢子囊呈帚状，孢子为一连串的分生孢子；黑曲霉的孢子囊为球形，分生孢子分布在孢子囊外，且黑曲霉在繁殖菌丝与营养菌丝连接处常有一膨大的足细胞；毛霉与根霉的孢子囊都为球形，但根霉具有假根，而毛霉没有。
（2）根据载玻片培养观察法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪些步骤可以根据具体情况做一些改进或可用其他的代替方法？
①实验中为了保湿在平皿中加入的是无菌水，但是用20%的甘油保湿效果会更好，用量也更少，不易洒出，建议用甘油替代无菌水保湿。
②培养用的琼脂块需要足够薄才利于观察，这对实验者对平板中培养基量的把握的要求比较高，建议可以改成涂层法，即用滴管吸取少量未凝固的培养基滴加到载玻片上，之后均匀涂抹开，涂出两个区域代替两片琼脂块，凝固后接种并盖上盖玻片。
（3）你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
①大小：这四者在显微镜下大小有显著差异，酵母菌与霉菌很大，低倍镜就可见，放线菌较小，需要高倍镜，而细菌必须在油镜下才可看见。 ②形态：霉菌与放线菌在显微镜下看到的都是缠绕的菌丝体，而酵母菌看到的是一个个卵圆形的个体，细菌则形态多样，大多为球状、杆状、螺旋状、链状等。
七、 附：马铃薯培养基1000mL配料表
马铃薯： 200 g 蔗糖： 20 g 琼脂： 15~20 g 水： 1000 mL pH： 自然
*马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000 mL。121℃灭菌30min。
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