枇杷叶中齐墩果酸的提取工艺

２０１１年４月　第３２卷第４期　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　食品研究与开发　基础研究　枇杷叶中齐墩果酸的提取工艺　樊爱萍。刘卫‘。闵勇，李四丽　（红河学院理学院化学系，云南蒙自６６１１００）　摘要：以微波法进行提取，采用最优的薄层分离一比色显色法测定齐墩果酸含量，确定出微波提取的最佳工艺为：乙　醇浓度９５％、提取功率为６３０Ｗ、微波时间为７０　ｓ、料液比为１：２０（ｇ／ｍＬ）。微波法与传统的热回流法、冷浸取法进行比　较，得出微波法的提取率为８４．８％，热回流法的提取率为６４．１％，冷浸法的提取率为６１．３％，即微波法提取率明显高　于其他２种方法，且结果显示微波法提取齐墩果酸有效可行。　关键词：枇杷叶；齐墩果酸；微波；提取　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｉｅａｎｏｌｉｃ　Ａｃｉｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　ＦＡＮ　Ａｉ－ｐｉｎｇ，ＵＵ　Ｗｅｉ　，ＭＩＮ　Ｙｏｎｇ，ＬＩ　Ｓｉ—ｌｉ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｈｏｎｇｈｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｅｎｇｚｉ　６６１　１００，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｔｈｉｎ—ｌａｙｅｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ—Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｌｏｒ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ．ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：９５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｏｗｅｒ　ｏｆ　６３０　Ｗ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｔｉｍｅ　７０　Ｓ。ｓｏｌｉｄ—ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１：２０．Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｒｅｆｌｕｘ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ　ｃｏｌｄ　ｓｏａｋ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｅｍｕｌａｔｅｄ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　８４．８％，ｈｅａｔ　ｒｅｆｌｕｘ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６４．１％，ｔｈｅ　ｃｏｌｄ　ｓｏａｋ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６１．３％。ｏｒ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ　ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｍｂ．）Ｌｉｎｄｌ；ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ；ｍｉｃｒｏｗａｖｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Ｅｒｉ０ｂｏｔｒｙａｉａｐ０ｎｉｃａ　（Ｔｈｕｎｂ　Ｌｉｎｄ１）的干燥叶，现代药学测验，枇杷叶含有　具有抗炎、抗病毒、免疫调节、抑制血小板聚集和抗氧　化等多种药理作用口１。由于齐墩果酸结构较为复杂，人　工合成较困难，从天然产物中提取齐墩果酸是获得齐　墩果酸的主要途径。从天然产物中提取的齐墩果酸对　动物无明显的毒、副作用，现在欧美国家现以将其加工　成保健食品，或者作为天然抗氧化剂应用到食品中Ｉ４１，　齐墩果酸具有很大的开发前景。　目前大部分研究人员对齐墩果酸的提取大都采　皂苷、苦杏仁苷、乌索酸、齐墩果酸、鞣质、Ｖｅ，、Ｖ　等化　学成分【ｌ＿２１，其中齐墩果酸是一种重要的成分，由于其　广泛的生物学活性，它具有非常高的药用价值，如抗肿　瘤、保肝作用和降血脂、血糖及抗艾滋病等作用外Ｉ】ｊ，还　基金项目：红河学院硕士专项基金（ＸＳＳ０７０１１）　作者简介：樊爱萍（１９７７一），女（汉），讲师，硕士，主要从事天然产物　开发研究。　用传统热回流法、索氏提取法、冷浸提取法嘲等方法，而　用微波法进行提取的研究鲜见报道。　●◆●●●●◆●●◆●◆◆●●◆●●●　通信作者：刘卫，教授，主要从事有机化学及天然产物研究。　【６】汪河滨，自红进，王金磊，等．黑果枸杞色素清除自由基活性的研　究【Ｊ］．食品研究与开发，２００６，２７（１１）：８－１０　［８】蓝航莲，孙树霞．柑橘类多糖的生理活性研究进展【Ｊｊ＿中国食物与　营养，２００３（２）：４４—６６　【７】汪海波，刘大川，余珠化，等．大豆异多糖类物质的提取、抗氧化　性及稳定性研究【Ｊ１］．食品科学，２００４，２５（１）：１１１－１１４　收稿日期：２０１０—０９—２０　基础研究　樊爱萍等：枇杷叶中齐墩果酸的提取工艺　，１材料与方法　１．１材料　１．１．１原料　枇杷叶：采自云南蒙自枇杷基地。　１．１．２主要实验仪器设备和药品　微波炉：德国进口，ＳＭＣ；离心机：常州国华电器有　限公司；７２００型分光光度计：尤尼柯一上海仪器有限公　司；ＴＵ一１９０１双光束紫外可见分光光度计；电热干燥　箱：９０３０（Ａ）１０１（Ａ）一０（ｓ）南京沃环；旋转蒸发仪：ＲＥ一　５２上海比朗；薄层Ｇ板；齐墩果酸标准品：上海融禾医　药科技有限公司；香草醛；冰醋酸；高氯酸；乙醇；浓硫　酸；硅胶层析粉；氯仿；丙酮等。　１．２方法　１．２．１齐墩果酸测定方法研究　薄层分离一比色显色：取１　ｍＬ供试样，标准液１　ｍＬ，　分别点于同一硅胶板上，以氯仿一丙酮（４：１）为展开剂　展开，取出，挥去溶剂，在对照品部位喷以１０％硫酸乙　醇溶液，于１０５℃烘箱中烘７　ｍｉｎ一８　ｍｉｎ至显示紫红　色，刮取与对照品相同位置以及等面积的斑点置于离　心试管中，同时刮取等面积空白硅胶作为试剂空白。　先精确加入新制的５％的香草醛一冰醋酸溶液０．２　ｍＬ，　振摇溶解后加入高氯酸０．８　ｍＬ，用封口胶封闭，摇匀后　置于７０℃水浴中加热１５　ｒａｉｎ，然后流水冷却，再加乙　酸乙酯４　ｍＬ，摇匀，离心取上层清液在最大吸收波长　处测定。　１．２．２完全提取实验　准确称量１．０００　０　ｇ枇杷叶粉末于锥形瓶中，按料　液比为１：２０（ｇ／ｍＬ），以９５％乙醇在６３０　Ｗ功率下提取　３次，再按１：１０料液比９５％乙醇提取２次，每次提取　７０　ｓ，合并提取液，定容于１００　ｍＬ容量瓶中，用薄层分　离一比色显色法测定吸光度。并根据以下公式计算提　取率：　齐墩果酸提取率＝提取出齐墩果酸质量（ｇ）／完全　提取齐墩果酸质量（ｇ）ｘｌ００％　（１）　２结果与分析　２．１　Ｒｆ值的确定结果　经过实验，用氯仿一丙酮（４：１）展开剂展开后，确定　出齐墩果酸的比移值为０．９２６、０．９３３、０．９３３、０．９００，取　其平均值为０．９３０，０．９００值偏低的原因可能是点样不　均匀以及展开剂比例不够精确引起的，故在以后试验　过程中取样时按比移值０．９３０进行取样测定。　２．２最大吸收波长的确定结果　紫外分光光度计扫描齐墩果酸标准溶液结果，如　９　表１所示。　表１紫外分光光度计扫描结果　Ｔａｂｌｅ　１　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　波长／ｎｍ　吸光度　波长／ｎｍ　吸光度　５３８．ｏ０　１．８８５　７　２５１．０ｏ　０．０２０　４　３７５．００　１．１７７　２　２４６．ｏ０　０．０１２　２　３５１．０Ｏ　１．１４９　０　２３８．００　０．０３９　２　３４ｌ＿ｏ０　１．１４１　６　２２１．０Ｏ　０．０２２　０　３３５．００　１．１５７　３　２１８．００　０．Ｏｌ２　Ｏ　２７０．０ｏ　０．０２９　５　由所测吸光度值可知，在波长为５３８　ｎｍ时吸光度　值最大，故选择５３８　ｒｉｍ为检测波长。　２＿３标准曲线的绘制　以标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，　绘制标准曲线，经计算得回归方程为：Ａ＝０．１５１　１Ｃ一　０．１７６　７３，ｒ＝０．９９６　３８，在４　Ｉ－￣ｇ／ｍＬ～２０　ｇ／ｍＬ范围内，线　性关系良好，结果见图１。　０－８　Ｏ．７　Ｏ．６　Ｏ．５　０．４　０＿３　０．２　Ｏ．１　０．Ｏ　—Ｏ．１　０　４　８　１２　ｌ６　２Ｏ　浓度／（　ｇ／ｍＬ）　图１齐墩果酸的标准曲线　Ｆｉｇ．１　Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　２．４测定方法的研究　有文献报道嘲采用比色法测定木瓜中的齐墩果酸　含量，但通过实验，所得枇杷叶提取液颜色呈深绿色，　即枇杷叶中的色素也大量溶出，对其溶液直接进行显　色测定，使其测定结果偏高很多，所以直接用比色法测　定并不适用于枇杷叶中齐墩果酸含量的测定。另外，有　文献报道川采用薄层分离一分光光度法测定威灵仙的　齐墩果酸含量，但通过将枇杷叶提取液用薄层分离后，　在比移值范围内取样、洗脱，在洗脱过程中易造成洗脱　不完全，增大测定误差，使测定结果偏低，另外用洗脱　剂洗脱一方面增加成本，另一方面也使工序更为复杂，　增加测定以及计算难度。　实验结果表明，采用薄层分离一比色显色法能消　除枇杷叶提取液中色素等杂质的干扰，且跑版后，不需　洗脱剂洗脱，而直接取样显色，一方面简化操作、节省　时间、降低成本，另一方面可减小操作误差，提高齐墩　果酸的显色灵敏度，使测定结果更准确、可靠。故本实　１０　验选取该法为测定方法。　樊爱萍，等：批杷叶中齐墩果酸的提取工艺　基础研究　ｉ；２．５．３提取时间对枇杷叶中齐墩果酸的影响　４　４　４　４９　９　８　８２．５微波提取的单因素实验　５　Ｏ　采用５０、６０、７０、８０、９０　ｓ不同提取时间提取齐墩　５　Ｏ２．５．１　乙醇浓度对枇杷叶中齐墩果酸的影响　采用７５％、８０％、８５％、９０％、９５％不同浓度的乙　醇一水溶液为提取剂提取齐墩果酸，测定提取液的吸　光度值，结果见图２。　１．６　１．４　１．２　毒１．０　０．８　０．６　０．４　７５　８０　８５　９０　９，　乙醇浓度／％　图２乙醇浓度对提取率的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　图２表明，齐墩果酸的吸光度值随乙醇浓度的增　大而逐渐增大，但随着乙醇浓度的增加，色素等杂质　的溶出也越多，对测定造成很大干扰，且随着溶剂浓度　的增加，其成本会随之增加。南冈２可知在８５％～９５％　乙醇浓度时，吸光度值趋于平缓，故从提取率及成本　考虑，选取８５％、９０％、９５％作为正交试验浓度因素的　３个水平。　２．５．２提取功率对枇杷叶中齐墩果酸的影响　采用３５０、４２０、４９０、５６０、６３０　Ｗ不同微波功率提　取齐墩果酸，测定提取液在的吸光度值，结果见图３。　３５ｏ　４２０　４９０　５６０　６３０　微波功率／ｗ　图３微波功率对提取率的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｐｏｗｅｒ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　图３表明，微波功率过低（３２０　Ｗ），齐墩果酸的提　取会不完全，而微波功率过高（＞５６０　Ｗ）时，使乙醇沸　腾，使提取剂的量减少，且对齐墩果酸的结构造成破　坏，所以当功率达５６０　ｗ后，增加功率会使齐墩果酸　的提取率下降。所以本试验选取４９０、５６０、６３０　Ｗ作为　正交试验的微波功率因素的３个水平。　果酸，测定提取液的吸光度值，结果见冈４。　ｌ　２５　１・２０　１－１５　１．１０　１．０５　ｌ・Ｏ０　０・９５　０．９０　５０　６（】　７０　０　９０　微波辐射时问／ｓ　图４微波辐射时间对提取率的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　由图４可以看出，吸光度值随提取时间的增大而　增大，在８０　ｓ时吸光度值达最大，之后随提取时间的　增加吸光度值反而降低，这可能是因为随着时间的延　长，微波提取温度会随之增加，长时间受热会造成齐墩　果酸分解，故本实验选取７０、８０、９０　ｓ作为正交试验的　提取时间因素的３个水平　２．５．４料液比对枇杷叶中齐墩果酸的影响　采用１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０（ｇ／ｍＬ）不同料液比　提取齐墩果酸，测定提取液在的吸光度值，结果见　图５　１．ｏ　０．９　０．８　ｏ．７　０．６　０．５　０．４　０．３　１ｏ　】５　２０　２５　３０　液料比／【ｇ／ｎ１Ｌ）　图５微波处理液料比对提取率的影响　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ｄｅａｌｉｎｇ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｔｏ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　南冈５得知，当料液比低于１：１０时枇杷叶粉末不　能被完全浸泡，达不到提取效果，当在１：２０时吸光度　值达到最大，随着料液比的增加，吸光度值下降，可能　是因为较高的料液比使得微波在一定能量下加热更多　的溶液，达不到提取温度，所需时间延长，吸光度值下　降，所以本实验选取１：Ｉ５、ｌ：２０、ｌ：２５作为正交试验的　料液比因素的３个水平。　２．６正交试验设计优选微波提取工艺　通过单因素试验，考察乙醇浓度、提取功率、提取　验一试一　●２　３　４　５　６　７　８　９　Ⅱ１卜一　Ｒ　基础研究　樊爱萍等：枇杷叶中齐墩果酸的提取工艺　，：：：，，　７　２　７　Ｄ　１１＝＝＝．　时间、乙醇用量４个因素，按Ｌ９（３　）安排正交试验，见　表２、３。　全提取，由公式（１）计算得到枇杷叶中齐墩果酸的含量　●：０●　为９０１．，●　２０８　ｔｘｇ／ｇ。　强　表２正交试验因素水平表　Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　●　：　表３正交试验结果　Ｔａｂｌｅ　３　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ａ乙醇浓度　Ｂ提取功率　Ｃ提取时间Ｄ料液比　吸光度　提取率『㈣㈣㈣嗍７　３　％　从表３中方差结果分析可以得出，４个单因素对　齐墩果酸的影响大小顺序为乙醇浓度＞料液比＞提取　时间＞提取功率，且枇杷叶中提取齐墩果酸的最佳提　取条件为Ａ　Ｂ，Ｃ　Ｄ　，即乙醇浓度为９５％，提取功率为　６３０　Ｗ，提取时间为７０　Ｓ，料液比为１：２０。　２．７提取方法的比较　经过实验得到热回流以及冷浸取中１　ｇ枇杷叶提　取得到的齐墩果酸的吸光度值，以及与微波法比较的　结果见表４。　表４对比实验结果　Ｔａｂｌｅ　４　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　从３种提取方法的比较结果得出，在提取时间、　料液比及提取率上微波法明显优于其他２种方法。微　波能有效节约提取时间以及很好的控制提取温度，保　护活性物质的功能成分不被破坏，所以本实验采用微　波进行提取，并通过单因素试验以及正交试验设计优　选ｆ｝ｌ最佳提取工艺条件。　２．８完全提取结果　经过５次提取后，枇杷叶中的齐墩果酸几乎被完　３结论　●通过对齐墩果酸测定方法研究以及微波提取单　，●　２　０　４　Ｚｍ　　因素试验和正交优选微波提取工艺的试验，得出以下　，　结论：：　　，　１）经过３种测定方法的研究比较得出，薄层分离一　比色显色法应用于测定枇杷叶中的齐墩果酸，结果更　可靠、　０　　９　３更有针对性。　Ｏ　㈣㈣　８　　２）由单因素试验以及正交试验设计优化得出微波　弧　提取枇杷叶中齐墩果酸的最佳工艺路线为：乙醇浓度　９５％、提取功率为６３０　Ｗ、微波时间为７０　Ｓ、料液比为　１：２Ｏ。　３）经实验得出微波法的提取率为８４．８％，热回流　法的提取率为６４．１％，冷浸法的提取率为６１．３％，且　从３种提取方法的条件比较得知，微波法在提取时间、　料液比上微波法明显优于其他两种方法，能更大程度　的节约时间，降低能耗以及成本，更适用于工业化生产　工艺。　４）经过实验得出蒙自枇杷叶中齐墩果酸的含量为　９０１．２０８　ｐＬｇ／ｇ。　参考文献：　［１］林玉霖，林文津，林力强．枇杷叶的研究现状与开发前景［Ｊ］．中药　材，２００６，２９（１０）：１Ｉ１１—１１１４　［２］国家医药管理局中草药情报中心站．植物药有效成分手册【Ｍ］．　北京：人民卫生出版社，１９８６：８００　［３】汤华成，张东杰，赵蕾．功能性食品因子齐墩果酸研究进展［Ｊ１．食　品科技，２００７（９）：１６—１８　［４】Ｐａｎ　Ｘ　Ｊ，Ｎｉｕ　Ｇ　Ｇ，Ｌｉｕ　Ｈ　Ｚ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆａｎｓｈｉｎｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｓａｌｖｉａｅ　ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚｅ　ｂｕｎｇｅｄ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｊ，２００２　ｆｌ２１：７１２７７　［５】唐丽琴，刘圣，李矗，等．高效液相色谱法测定枇杷叶提取物中齐　墩果酸与熊果酸的含量［Ｊ】．中国医院药学杂志，２００４，２４（１２）：７２６—　７２６　［６】董海丽，纵伟．薄层分离一分光光度法测定木瓜中的齐墩果酸｝ＪＪ．　安徽农业通报，２００７（１５）：２６—２８　【７］熊慧林，郑茂鑫．薄层扫描法测定威灵仙中齐墩果酸的含量『Ｊ】　．中国中药杂志，２００７，３２（２）：３５７—３５９　收稿日期：２０１０—０８—０９　９　７