对于生命科学研究来说，如何寻找到一个理想的研究系统是其关键所在。回顾近代生命科学研究的历史我们不难发现，在许多划时代的突破性科学成就背后总有一些模式物种的默默奉献：假若不是选择果蝇这一绝好的模式动物，摩尔根又怎能揭开“基因的连锁与互换”这一经典遗传学的第三大规律；假若没有利用非洲爪蟾所进行的体细胞核移植开创性工作，又怎会有今天克隆羊、克隆牛、克隆鼠的诞生；假若不是有酵母、海胆的“帮助”，又怎会有今天对细胞周期调控机制的了解；假若不是线虫的“贡献”，又怎会有对细胞凋亡机制的认识……类似的例子不胜枚举。事实上，各种各样的模式动物与植物已经或正在走进生命科学研究的阵地，常见的如非细胞生物T4病毒，原核生物大肠杆菌，真核生物酵母、果蝇、小鼠、线虫、海胆、非洲爪蟾、斑马鱼、水螅等，植物如玉米、拟南芥、豌豆等，它们都因其所具有的独特的生物学特性而成为各种研究的模型，且都已被研究的相对比较透彻。所有这些具一定代表性的生物常被统称为模式生物（model organism）。
模式生物与实验生物（experimental organism）并非一回事。能成为模式生物的实验生物通通常具有易于培养、操作简单、生长繁殖快等特点，且均具有一些独特的生物学特性，适宜于进行一些具有一定广泛性和代表性的研究工作。本章将就一些有代表性的模式生物的生物学特性及其在分子细胞生物学研究中的作用进行探讨。
第一节 酵母
一 、概论
酵母为单细胞真菌，属半子囊菌亚纲（Hemiascomycetes）内孢霉目（Endomycetales）酵母菌科（Saccharomycetaceae）。作为模式生物的酵母主要有两种：一种是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia），其无性生殖方式为芽殖，故又称芽殖酵母（budding yeast）；另一种是粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycs pombe），其无性生殖方式为裂殖，故又称裂殖酵母（fission yeast）。这两种酵母虽然同属于子囊真菌，均为模式生物，但二者在进化上的亲缘关系较远，在许多方面并不相同。例如，粟酒裂殖酵母营养体为单倍体，而酿酒酵母营养体则为二倍体，这使得二者的生活史刚好相反。
酵母作为一种模式生物在实验系统研究方面具有许多内在的优势。（1）酵母易于培养和操作、增殖快，是研究真核生物生命活动的首选模式生物，有真核生物中的“大肠杆菌”之称。（2）酵母能在单倍体和二倍体的状态下稳定均能生长，并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换。单倍体细胞可以是两个交配型中的任何一个，分别被称为a和α，二倍体细胞（a／α）由a细胞和α细胞融合而成，并可进一步通过有丝分裂进行无限期增殖。这对其基因功能的研究十分有利，如在单倍体状态下，只需一次基因替换，就能得到某个特定基因缺失的酵母株；而对于一些缺失后致死的基因，人们可以在二倍体菌株中进行基因替换，然后通过孢子筛选，获得带有基因缺失的单倍体菌株。（3）酵母DNA只存在于细胞核中，酵母菌染色体功能的支持主要由复制起点（ARS元件）、着丝粒（CEN元件）和端粒(telomer) 构成，利用这些元件、克隆化的酵母选择基因能构建出既可在酵母菌又可在和大肠杆菌中进行稳定的自主复制与表达的穿梭质粒，构建出更适合真核生物基因表达的载体系统，甚至还可利用酵母染色体的这些元件构建出更大、更为有效的大片段序列克隆系统，如酵母人工染色体（YAC）。同时，酵母菌还具有同时兼容几种不同质粒（带有酵母固有质粒2μm复制子）的特点，这与大肠杆菌明显不同。（4）酵母的生命周期很适合经典的遗传学分析，使得在酵母条染色体上构建精细的遗传图谱成为可能。更重要的是，目前已发展了一些非常有效的技术使得酵母基因组中约6000个基因中的任何一个基因均能被突变的等位基因取代，甚至从基因组中完全缺失，这种方法具有很高的效率和准确性。（5）酵
母的基因组很小，比如酿酒酵母的单倍体就含有16条200－2200kb的线性染色体，DNA容量仅为大肠杆菌的3.5倍。通过完整的基因组测序其基因组大小为12068kb，编码5885个专一性蛋白质的开放阅读框。而裂殖酵母的基因组大小尽管与酿酒酵母相近，但仅分布在3条染色体上，编码4824个蛋白质。这意味着在酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有72％的核苷酸顺序由开放阅读框组成。这说明酿酒酵母基因要比其它高等真核生物基因排列紧密。如在人类基因组中，大约平均每隔30kb或更多的碱基才能发现一个编码蛋白质的基因。酵母基因组的紧密性是因为基因间隔区较短与基因中内含子稀少。酵母基因组的开放阅读框平均长度为483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的开放阅读框(4910个密码子)。此外，酿酒酵母基因组中还包含有大约140个编码rRNA的基因，排列在XII号染色体的长末端；40个编码snRNA（small nuclear RNA ）的基因，散布于16条染色体；属于43个家族的275个tRNA基因也广泛分布于基因组中。表6-1提供了酿酒酵母基因在各染色体上分布的大致情况。
表6-1 酿酒酵母染色体简况
染色体编号 I II III IV V VI
染色体长度（bp） 2.3×10 807188 3.15×10 1531974 569202 2.7×10 1090936 5.61×10 439886 745442 666448 1078171 924430 784328 1092283 948061
5554
基因数目 89 410 182 796 271 129 572 269 221 379 331 534 459 419 560 487
tRNA基因数目 4 13 10 27 13 10 33 11 10 24 16 22 21 15 20 17
VII VIII IX X XI XII XIII XIV XV XVI
二、酵母与细胞周期研究
真核生物的细胞周期是一个严格按照G1→S→G2→M循环运转的增殖过程。酿酒酵母和裂殖酵母的细胞周期存在着一定的差异：（1）由于酿酒酵母的有丝分裂为核内分裂方式，其纺锤体常在S期就开始形成，故而其细胞周期几乎是缺少G2期或被认为是S期与G2期重叠，而裂殖酵母却具有完整的细胞周期。（2）酿酒酵母染色质在间期凝集的程度亦较，但裂殖酵母的染色质在间期的可被压缩大约2000倍。（3）酿酒酵母细胞周期中的G1期所占时间最长，是研究真核细胞细胞周期由G1→S期过渡的好模型，而裂殖酵母的G2期在细胞周期中所占的比例也最大，是研究真核细胞细胞周期由G2→M期过渡的好模型极佳模型。
在 20世纪 60年代末，美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的利兰· 哈特韦尔 (Leland Hartwell)采用遗传学方法，用酿酒酵母作为实验对象研究细胞周期。20世纪70年代，他通过温度敏感突变技术筛选出一些突变酵母细胞，这些突变的酵母细胞常停滞在特定的细
胞周期时相，通过对相关突变的分析从而确定缺陷基因所编码的蛋白质在细胞周期调控中的作用。利用这种方法，他成功地分离出上百个涉及细胞周期调控的基因，并将它们命名为细胞周期分裂基因（cdc）。
继哈特韦尔之后，英国伦敦帝国癌症研究基金会 (Imperial Cancer Research Fund, ICRF)的保罗·纳斯（Paul Nurse）和蒂莫西·亨特 (R. Timothy Hunt)，分别利用裂殖酵母和海胆发现了调节细胞周期的关键分子细胞周期素蛋白依赖性激酶（CDKs）以及调节CDKs功能的细胞周期素（cyclin）。纳斯从裂殖酵母中筛选出了调控细胞周期进程的关键基因cdc2，并且发现cdc2和酿酒酵母的cdc28具有69%的同源性，均编码一个34kDa的蛋白激酶（p34cdc2），其功能可以相互代替，参与G1/S和G2/M转换的调控。同时，他还证实了人的cdc2与酿酒酵母cdc28具有64.5% 的同源性。因此，纳斯认为以cdc2（cdc28）对细胞周期的调控机制在真核生物中具有普遍性。并于1990年提出了“Ｍ期启动调节的普遍机制”，认为“从酵母到海洋无脊椎动物直至人类的所有真核细胞中都存在一个共同的分子机制来调节Ｍ期的启动”。cdc2与cdc28基因的编码产物CDC2和CDC28就是最早发现的CDKs。 而蒂莫西·亨特通过用海胆做模型发现了蛋白质的周期性降解，这种周期性降解的蛋白就是细胞周期素，并阐明周期素的降解是细胞周期中一种重要的普遍控制机制。
目前，从酵母中所鉴定出来的细胞周期相关基因已达已达200多个，其中许多都在人类和哺乳类动物中找到了同源基因，而仅在人体内就发现了十余种不同的周期素，并较为成功地揭示了细胞周期的调控机制
三、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system ）
细胞生命活动中的许多过程诸如酶催化代谢反应、信号转导、蛋白质的修饰与加工、蛋白质的转运等都表现为一种蛋白质与蛋白质间的相互作用。传统的免疫印迹、Western blot等方法很难满足对蛋白质分子之间相互作用这一动态过程的研究需要。在这样的需求下， Fields S和Song O于1989年创立了一种非常简便而有效的研究蛋白质相互作用的方法——酵母双杂交系统，它最突出的特点是可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用，而且还可通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用蛋白的基因。酵母双杂交系统一经问世，便极大地加速了人们对蛋白质功能和生命活动分子机制的认识进程。
（一） 酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的理论基础源自20世纪80年代末对真核转录因子特性的认识。研究证实，很多真核基因的表达通常处于本底水平或不表达，在有转录激活蛋白的诱导的情况下才会出现高水平表达。通常，这种转录因子均具有两个相互独立的功能：与特异性 DNA序列（启动子）结合的功能和引导RNA聚合酶激活转录的功能。同时更重要的发现是：这两种功能分别由两个独立的功能区域负责，即DNA结合结构域 (DNA-binding domain，DNA-BD) 和转录激活结构域 (activation domain, AD)。通常，前者负责结合基因上游顺式激活序列 ( upstream activation sequence, UAS)，后者则负责引导RNA聚合酶复合体激活基因转录。DNA-BD和 AD对激活转录均是必不可少的，在理论上，任何一个AD都可以与任何一个 DNA-BD结合并激活转录，即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白。不仅如此，只要 DNA-BD和AD能够通过一定的方式在空间上足够的靠近（例如借助其他蛋白质的帮助使其足够靠近），这样，即使它们之间没有共价结合也同样可以激活转录。 目前最成熟也最常用的DNA-BD和AD均来自酵母的GAL4转录因子(它们分别定位于 1-147位和768 -881位氨基酸)。第一步，通过DNA重组技术设计两个杂交蛋白：将编码已知蛋白质 (常称为诱饵蛋白，bait protein)的基因与编码BD的序列融合并在酵母中表达产生融合蛋白BD-Bait，同时将编码末知蛋白 (该蛋白常称为捕获蛋白或猎物蛋白，prey protein)的基因与编码AD的序列融合并在酵母中表达产生另一融合蛋白AD-Prey。第二步，将表达
上述两个杂交蛋白的载体通过共同转移到一特别的酵母细胞株中去。该酵母中的gal4基因是缺失的，但却有一个受GAL4转录因子激活的报告基因（一般是β-半乳糖苷酶基因。这样，如果诱饵蛋白和猎物蛋白能够相互作用的话，就会使DNA-BD和AD发生，从而激活报导基因转录。如果诱饵蛋白和猎物蛋白不能发生相互作用，则DNA-BD和AD不能结合的话，报导基因的转录就不能被激活。
与许多传统的方法相比 ,酵母双杂交系统具有重大的突破：（1）整个操作均在体内进行，避免了体外条件下所出现的许多不利因素的影响；（2）灵敏度高，尤其是在检测蛋白质之间弱相互作用时更为突出；（3）勿需进行蛋白的纯化等操作，整个过程较为简单；（4）所使用诱饵蛋白既可以是完整蛋白，也可以小到仅为一个功能结构域。
图6-1 酵母双杂交系统的原理
（二） 酵母双杂交系统的应用
酵母双杂交系统现已被广泛应用于包括核蛋白、胞质蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白、胞外蛋白等各种蛋白质在内的的功能研究中。根据研究目的之不同常被用于：（1）检测已知的蛋白之间是否存在相互作用；（2）寻找蛋白质发生相互作用所必需的功能结构域（domain）或基序(motif)；（3）寻找可与已知蛋白结合的未知蛋白；（4）确定蛋白或多肽类药物的作用机理。
（三） 酵母双杂交系统的发展
大量未知的、重要的蛋白质之间的相互作用已随着酵母双杂交系统这个方法的广泛应用而被揭示。同时近年来为了适应更广泛的用途，在原有酵母双杂交系统基础上发展了大量的衍生系统：如用于研究蛋白质-DNA的相互作用的单杂交系统（one-hybrid system）；用于研究解离或破坏蛋白质相互作用因子的逆向双杂交系统（reverse two-hybrid system）；用于研究蛋白质-蛋白与RNA、多肽、小配体等不同种类分子的相互作用的三杂交系统（three-hybrid system），这种三杂交系统既利用了双杂交系统中的两个融合蛋白AD-Prey和BD-Bait，同时这两个融合蛋白的相互作用必须借助于第三种分子，而这第三种分子可以是蛋白质、小分子多肽和核酸，因而就产生了蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统、RNA三杂交系统等类型。
此外，还出现了为研究膜蛋白的相互作用而改进的SOS富集系统 ( SOS recruitment system，SRS)。在该系统中，蛋白质之间的相互作用被人为限制在酵母细胞膜上。 四、酵母与基因功能研究
酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，其重要作用还体现在：当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以通过到相关酵母基因组数据库中检索与之同源的功能已知的酵母基因，并获得其功能方面的相关信息，从而加快对人类基因的功能研究。
有许多涉及遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深对这些遗传性疾病的了解。例如，早在1970年Cleaver等就曾报道，着色性干皮病和紫外线敏感的酵母突变体都与缺乏核苷酸切除修复途径(nucleotide excision repair，NER)有关。1990年，人们就克隆了着色性干皮病相关基因XPD，并发现它与酵母NER途径的RAD3基因有极高的同源性（参见表13-14）。Francoise等研究了170多个通过功能克隆得到的人类基因，发现它们中有42%与酵母基因具有明显的同源性，这些人类基因的编码产物大部分与信号转导途径、膜运输或者DNA合成与修复有关，而那些与酵母基因没有明显同源性的人类基因主要编码一些膜受体、血液或免疫系统组分，或人类特殊代谢途径中某些重要的酶和蛋白质。 五、几个与酵母有关的网站
http://www.yeastgenome.org/
http://cmgm.stanford.edu/pbrown/explore/ http://cgsigma.cshl.org/jian/
http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/ http://www.proteome.com/YPDhome.html
第二节 果蝇
一、概述
果蝇（fruit fly 或 vinegar fly）是一种广泛存在于全球温带及热带气候区，以腐烂水果为主食的一种昆虫。果蝇的生活周期短，繁殖快，子代多。一般在250C下由卵发育成成虫大约需要11天，在180C则所需时间加倍，在160C则需要3倍的时间。此外，果蝇的饲养也极为简单，而且还有大量易于辨认的体外表型，适合大规模饲养。
在全球所发现的果蝇的种类大约有1000种之多，但被用于科学研究作为模式生物的主要是黑腹果蝇（drosophila melanogaster）。
1998年，Celera公司开始对果蝇基因组进行研究，在不到两年的时间里破译了果蝇的序列，并于2000年3月宣布了基因组全序列为180Mb，包括有13601个基因，其中一半的基因功能还没有搞清楚，有1600个碱基跨度区仍未能完全测序。果蝇基因组的完成使人们确信“全基因组鸟枪法”( whole genome shotgun)和“片断处理法”的结合将成为解译大基因组最有效的方法。另外，Celera在果蝇基因组计划中发现了几千条新基因，这些新基因与一些重要蛋白例如激酶、离子通道、分泌蛋白、G-蛋白受体等有关。这些重要蛋白在研究新的医疗方法和杀虫剂方面都有极重要的价值。 二、 模式生物果蝇的应用
自从摩尔根使果蝇成为经典遗传学的主要模式生物以来已有100年了。果蝇作为一种重要的模式生物在生物学研究中占有重要位置，其它最大的优势在于基因组已研究清楚，而且易于进行遗传操作，有较丰富的行为，它作为研究遗传、发育、神经系统退行性疾病、学习记忆和类认知行为的模式生物亦受到了广泛重视，被誉为“遗传学与分子发育生物学国王”。对果蝇的研究也分别于1933年、1946年、1995年三度获得诺贝尔奖。 （一）果蝇与基因定位研究
黑腹果蝇是经典遗传学家喜欢的实验材料。当年摩尔根就是利用果蝇才发现了“基因的连锁与互换”定律。果蝇不仅饲养容易、繁殖快，有着很多很容易鉴别的表型，是典型的“雌雄异体”生物，雌雄容易识别，可以进行各种有目的的交配，得到各种重组性状，进而揭示
基因的位置。“遗传作图”的建立在很多方面是采用了研究果蝇得到的经验。
果蝇只有三对染色体。更有趣的是，果蝇幼虫的唾液腺的染色体很大，大到人的肉眼就可以看到，上面还有有规律的条纹，可以把一个基因的位点准确定位到某一条纹上。 （二）果蝇与基因功能鉴定 在经典的遗传学研究中，基因的功能主要是通过反向遗传学的方法而确定的。即先使某个基因产生突变，通过分析基因突变后的异常表型从而再反推正常基因的正常表型。传统的基因诱变主要是通过物理和化学诱变的方法而实现的。但自从发现果蝇中存在转座子（如P因子）后，通过利用独特的Ｐ因子插入诱变法，实现了大规模诱发单基因突变并进行基因功能研究。
Ｐ因子是果蝇中的一种自主转座因子，由转座基因和转座酶两个基因组成。当转座基因和转座酶基因两者都存在时，Ｐ因子转座，从而引起插入位点及其附近的基因产生突变；但如果转座酶基因缺失，转座便不能发生。根据上述理论依据，因此只要建立两个品系，其中一个含有正常的转座基因，而转座酶基因异常；另一个含有正常的转座酶基因，而转座基因异常，则在该品系内，转座便不能发生。但若让两个品系杂交，则F1代可以发生转座，并大规模地引起插入位点的单基因产生突变。由于Ｐ因子的插入位点可以通过染色体原位杂交的方法检测到，而Ｐ因子插入位点两侧的基因又可以通过质粒获救的方法克隆出来，因此果蝇的Ｐ因子诱变与其它生物只能通过化学诱变的方法相比，不仅诱变效率高，而且所诱发的主要是单基因突变，并且诱变基因容易分离和克隆，使后续的研究更加方便和容易。
基因组测序的结果显示，人类基因与果蝇的同源性高达80％，大多数人类基因为昆虫同等物的复制（根据Holland PWH与Miklos GL以及Rubin GM的研究）。人类和果蝇之间同源性，不仅仅只表现在简单的结构域和蛋白质的保守，实际上，某些复合物和多步骤的代谢途径也是保守的。而果蝇与人类基因的这种同源性必然使得对人类基因功能的解析更为快捷。
（三）与人类疾病
根据美国能源部的相关统计，利用模式生物果蝇，已有100多种人类疾病的致病基因被鉴定出来。
而我国学者，湖南师范大学生命科学学院吴秀山博士所率领的的课题组，利用Ｐ因子插入诱变法已在果蝇体内筛选出200多个导致心脏畸形的突变系和100多个周围神经突变系，然后初步克隆和鉴定了50个有关人类心脏发育的候选基因，该成果已申请了7项国家发明专利。中科院上海生化所研究员费俭等人在实验鼠身上发现，当神经系统负责传递抑制性信号的GABA转运蛋白过度表达时，小鼠的学习记忆力就变得差劲，并会诱发癫痫等疾病，为研制人为调控基因的药物提供了有益启示。 三、几个与模式生物果蝇有关的网站
http://www.hanfbuch.de/datenbank/schaedling.htm http://flybase.net/
http://www.fruitfly.org/
http://www.tigr.org/tigr-scripts/tgi/T_index.cgi?species=drosoph http://www.sciencemag.org/feature/plus/sfg/special/special.html#fly http://sdb.bio.purdue.edu/fly/aimain/1aahome.htm
http://sdb.bio.purdue.edu/dbcinema/kaufman/kaufman.html http://flyview.uni-muenster.de/
第三节 小鼠
一、概述
小鼠属脊椎动物门，哺乳纲，啮齿目，鼠科，小鼠属动物。小鼠的世代短，成熟早，繁殖很强，属全年、多发情动物，一年可产仔胎数6－10胎，每胎产仔数8－15头，且具有体型小、易于管理等特点。
在进化上，小鼠与人类的距离较近，约有1亿年。其解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人接近，为人类疾病的克隆提供了极佳的实验材料。作为经典的医学实验动物，小鼠已经对医学诸多领域的研究作出了卓越贡献。 二、小鼠成为模式生物的历程
从第一次被作为实验材料，到基因组测序的完成，小鼠在遗传学研究中已经有上百年的历史了。作为十分重要的模式生物之一，小鼠不仅为基础生物学研究做出了一系列重要贡献，更是在人类认识自身，战胜疾病的进程中功不可没。回顾历史，我们不难发现，小鼠成为重要的模式生物是偶然中的必然。
小鼠成为模式生物大概经历了以下几个阶段。 （一）属鼠的出现
鼠属出现在地球上大约是在6000万年前，。 （二）宠物鼠的出现
19世纪，由于宠物爱好者在19世纪选择性的饲养家鼠，从而逐渐出现了一些具有各种可爱颜色皮毛的宠物鼠。 （三）从宠物鼠到实验鼠
1897年，生物学家William Haacke 发现白鼠和杂色鼠杂交会产生重组表型。他注意到所出生的第一代老鼠全部是杂色的，但到了第二代却出现了重组表型：既有白色鼠又有杂色鼠。William Haacke观察到的现象实际上已经触及了孟德尔遗传学，但却因为没有严格的实验数据，使得他的报告受到了一些争议，这项重要的工作最终也被忽视了。
20世纪初，科学家们也开始意识到可以用这些不同颜色的老鼠进行一些遗传学实验，这些宠物鼠成了实验鼠的“先驱”。
1902年，哈佛大学的William Ernest Castle利用以一位名叫Abbie Lathrop的退休教师所饲养的宠物鼠为实验材料，通过对这些老鼠的毛色进行观察，以验证孟德尔定律的正确性。
1905年，法国遗传学家Lucien Claude Cuéno通过对黄白相间的杂色鼠进行研究发现，两个携带黄色皮毛基因的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老鼠的数量比总是2:1。Cuénot据此认为，黄色基因对白色基因来说是显性的。但是这个数据似乎并不完全符合孟德尔法则，因为按照孟德尔法则，黄鼠与白鼠数量之比应当是3:1才对，另外那部分黄色老鼠究竟哪去了呢？后来，Castle 和 Little经过研究才终于发现，原来那些“失踪”了的老鼠在还未出生就死掉了！这意味着，携带两个黄色基因对老鼠来说是致死性的！同时，这也是所报道的第一个等位纯合致死基因。
1909年，一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家Clarence Cook Little，培育出了第一个近亲繁殖的小鼠株系――DBA。他坚信研究遗传物质纯合的老鼠种群更有助于解开人类疾病的秘密。小鼠DBA株系被公认为第一个现代实验鼠株系，而且直到今天它仍然是遗传学实验室中的重要实验材料。
1921年，Clarence Cook Little又将从Abbie Lathrop的农场里买回来的一只编号为57的雌性小鼠的后代培育成了著名的C57BL的小鼠株系，成为使用最广泛，最重要的小鼠株系之一。
1929年， Hudson在汽车公司的巨头Edsel Ford和Roscoe Jackson两位大财阀的资助下，
Charence Cook Little 在美国的缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室。该实验室随后成了世界上最重要的老鼠遗传学研究中心之一。 （四） 成为重要的模式生物
近交系小鼠的建立极大推动了以小鼠为模型的科学研究，目前已建立的品系有近千种之多，常用的近交系小鼠也有50个品系之多。
1916年，Clarence Cook Little 和 Ernest Tyzzer 通过利用近交系小鼠进行肿瘤移植发现了肿瘤移植排斥现象。随后，Jackson实验室的George Snell对此问题进行了更深入研究，终于在20世纪40年代发现了组织相容性基因。这项重要的发现从此开辟了免疫学研究的新时代。Snell也因此荣获了1980年的诺贝尔奖。
1972年，Jackson 实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库，取代了以往的卡片式文件数据库。
1982年，Richard Palmiter 和 Ralph Brinster 领导的一个小组将一个能够被锌调控的DNA元件与大鼠的生长激素基因构建在一起，通过将其注射到小鼠胚胎中，从而培育出了第一批转基因小鼠。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新浪潮。
1987―1989年，Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个研究小组通过对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因剔除小鼠。
1998年，也就是在1997年克隆羊“多莉”诞生之后不久，夏威夷的一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。
1999年，人类基因组三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC)。小鼠基因组测序项目正式启动。到2002年，MGSC已经发展到了拥有6个国家的26个研究机构。
2001年6月，美国公司的私人公司Celera 使用鸟枪法测得了用于销售的小鼠序列草图。该小鼠序列草图是一种一次性测得基因组全序列的技术。Celera 公司的序列基于四个小鼠株系，其中包括了DBA株系，但不包括公共基金项目已经在测的C57BL/6J株系。
2002年8月，MGSC公布了小鼠基因组的的物理图谱，同年12月，MGSC公布了C57BL/6J品系小鼠基因组序列草图，覆盖了96％的常染色质区，并且做了分析。这个基因组大小约为2.5Gb，比人类基因组要小14％，预计基因的数目也少于30000个。约有40%的小鼠和人类基因组序列高度相似，99%的小鼠基因均能在人类基因组中找到相应的基因（80%的人类基因在小鼠基因组中能找到相应的基因）。 三、模式生物小鼠的应用
（一）转基因小鼠与基因剔除（knock out）小鼠
图6-2 带有人生长激素基因的转基因小鼠（右侧小鼠为转基因小鼠，左侧为正常小鼠）。
Richard Palmiter 和 Ralph Brinster利用基因工程技术所改造的“超级小鼠”（supermouse）创立了“转基因小鼠”这一崭新的实验系统，为基因的表达和功能鉴定提供
了一个理想的实验系统。基于DNA同源重组理论的“基因打靶”（gene targeting）/ “基因剔除”，使得利用“转基因小鼠”系统研究基因功能更加完善。到目前为止，已经至少有80多种转基因小鼠和200余个基因剔除小鼠被建立起来了。
最近，通过将人类基因克隆进小鼠胚胎干细胞建立“活体文库”（in vivo library），又为基因组学研究提供了一种崭新的思路与技术。 （二）小鼠突变品系与人类疾病研究
过去100多年的实践证明，小鼠已经成为建立人类遗传性疾病的动物模型的最佳实验材料。小鼠生理生化和发育过程和人类相似性，基因组的高度同源性以及的基因组改造技术的成熟性，均说明利用小鼠建立人类疾病的模型可以真实模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应。因此，利用小鼠等模式动物建立的人类疾病模型具有重大理论和运用价值。
七十年代末，Nusslein-Vollhard和Wieschaus运用EMS对诱变产生的果蝇突变系进行大规模筛选，他们的工作为系统研究果蝇的发生发育机制建立了新的理论，推动了整体生物学的发展，并因此而获得了诺贝尔奖。从90年代末，利用ENU（ethylnitrosourea，乙基亚硝基脲，一种类似于EMS的烷化剂）进行化学诱变，已成为了最有前景的产生突变型小鼠的方法。在过去的几年中已有上千种新的突变型小鼠被筛选出来。从基因功能改变的角度来看，ENU不但可以诱导基因功能完全性缺失突变 (null mutation)，也可以导致基因功能部分缺失性突变 (hypomorphic or hypermorphic mutation) ；从DNA结构改变的角度来看，ENU作为一种DNA烷化剂主要造成点突变 (point mutation)。基于上述这些特点，ENU诱变产生的小鼠动物模型更能真实的模拟人类遗传疾病。而在另一方面，通过对小鼠的疾病模型的深入研究将为生物医药技术产业带来了巨大商机。目前，几乎所有新培育的小鼠模型，特别是心血管、代谢疾病及老年病等严重危害人类健康的重大疾病的动物模型都被申请了专利。以我国小鼠遗传工程资源库的研究成果为例，研究人员运用ENU诱变方法已经得到了30多种小鼠突变品系，其中包括白内障、耳聋、骨密度异常、肢体缺陷及毛发异常等，克隆了部分相关突变基因，这些突变基因将为这些疾病的治疗找到新的药物靶点，并为新药的筛选和开发提供模型。再比如，我国南京大学模式生物遗传研究中心通过对不育小鼠品系的研究，先后找到16个候选致病基因，为人类不育症研究提供了非常重要基础。 四、几个与模式生物小鼠有关的网站
http://www.informatics.jax.org/
http://www.rodentia.com/wmc/toc.html http://genex.hgu.mrc.ac.uk/
http://www.nervenet.org/mbl/mbl.html
http://lgsun.grc.nia.nih.gov/cDNA/cDNA.html
第四节 斑马鱼
一、概述
斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。
更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的，这就使得人们不仅可以很容易得到胚胎，而且还可以在显微镜下直接观察斑马鱼胚胎发育的过程，不仅可作为脊椎动物模型来研究脊椎动物的胚胎发育过程，还是一种可用于人类疾病的研究
的模式生物。
图 6-3 斑马鱼照片
二、斑马鱼成为模式生物的历史
斑马鱼作为模式生物仅有20多年的历史，最早将斑马鱼作为模式生物研究的是美国Oregon大学已故的著名遗传学家George Streisinger，其标志为1981年他在《Nature》杂志上所发表的关于斑马鱼人工雌核发育的研究的论文。从此，斑马鱼开始引起人们的关注。1994年，以“斑马鱼发育和遗传”为主题的会议在冷泉港召开。1996年，著名的《Development》杂志上发表了一系列与斑马鱼各系统组织 (心血管、脊索、脑等 )发育的突变体有关研究的报告，从而揭开了斑马鱼用于基因、基因组学组、脊椎动物发育以及人类疾病研究的序幕。2002年5月，《Science》杂志又刊出了一期有关斑马鱼的研究专辑，标志这一斑马鱼为模式生物的研究进入到一个新的阶段。 三、模式生物斑马鱼的应用
斑马鱼在工业实验室中常被用作毒理学检验，是国际标准化组织推荐的五种实验鱼种之一。但随着对斑马鱼的进一步了解，其作为模式生物在生命科学以及医学研究中的作用正在崛起。
（一） 以斑马鱼为模型研究目的基因在脊椎动物中的表达和功能
利用斑马鱼胚胎透明的特点，构建绿色荧光蛋白（GFP）与内源性靶蛋白的融合蛋白，通过观察融合蛋白的荧光分布情况，借以确定目的基因或目的蛋白的功能和表达特点。同时，还可通过检测绿色荧光的分布，监测外源蛋白的表达在斑马鱼中的表达与分布情况。 （二） 斑马鱼与免疫学研究
斑马鱼作为免疫学新模式生物的优点在于：（1）与传统的免疫学模式生物——小鼠相比，斑马鱼有体型小，子代数量多，培育要求低，易于养殖，饲养成本低，便于开展大规模研究。（2）斑马鱼个体发育过程是在全透明状态下完成，使得整个心血管系统的发育过程能十分完整的被观察。特别是免疫系统个体发育的相关资料，是无法从小鼠上所进行的实验中轻易获得的。（3）先期对斑马鱼的遗传学研究积累的丰富突变库也为研究免疫相关基因的功能提供了条件。(4)在目前已知生物中，鱼类是最早具备获得性免疫系统的纲。这就使得对斑马鱼免疫系统的研究成为人们了解非特异性免疫系统和获得性免疫系统进化与功能相互关系的重要工具。这个独特的免疫系统进化地位还赋予了斑马鱼作为免疫学研究模式生物的另一重要优势，即其成体可以在没有胸腺、淋巴细胞生成的情况下存活传代，这又是小鼠模型无法比拟的。
1999年，Herbomel等在观察斑马鱼的巨噬细胞个体发育时发现，处于胚胎发育早期的斑马鱼巨噬细胞就具有对外源微生物大肠杆菌高效吞噬的能力。在受精30小时后，胚胎巨噬细胞就已经可以吞噬清除血液内和局部组织中的外源微生物。当给非血液系统中注射大肠杆菌后，5小时后即可在局部被斑马鱼巨噬细胞清除，且此时除了感染局部的30——50个活化巨噬细胞外，血液中未接触病原体的巨噬细胞也同样表现出活化特性，这提示斑马鱼体内可能还存在与哺乳动物相类似的细胞因子或趋化因子系统。
2001年Yoder等报道了斑马鱼与人白细胞表面受体基因簇同源的序列，并通过体外转染实验证明，斑马鱼在该区域的与ITAM基序高同源性的蛋白质同样有抑制小鼠MAPK信号途径的功能，进而还可抑制NK细胞的活化，这进一步显示出斑马鱼和人在该区域的基因结构和功能都是保守的。
2002年Neely等首先建立了细菌感染致病性链球菌的斑马鱼模型。该研究选用链球菌 作为病原菌对斑马鱼进行攻击实验，得到了较为全面的感染过程、致死剂量、生存曲线资料，为进一步研究非特异性免疫反应中宿主和病原体相互奠定了坚实的基础。 虽然斑马鱼作为免疫学研究的模式生物研究还只是开头，但有理由相信，随着斑马鱼基因组计划的启动，将会有越来越多的淋巴细胞特异性表达基因将被相继克隆并，并会为人们进一步探索淋巴细胞的成熟、归巢等提供了良好的研究平台。 （三）斑马鱼与人类疾病研究
据估计，斑马鱼的基因组中约有约30000个基因，这个数目与人差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。斑马鱼的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85％与人类相同，尤其是其心血管系统的早期发育与人类极为相似，故斑马鱼是研究心血管疾病基因的最佳模式生物。
更为难得的是，斑马鱼中的肿瘤发生情况与人类亦极为类似。斑马鱼的基因特点使它研究可以成为一种很好的人体肿瘤模型。不久前，Langenau等通过将与人类白血病和淋巴瘤发生密切相关的鼠源性的c-Myc基因与一个存在于斑马鱼淋巴细胞内的Rag2基因启动子相融合，再将融合基因的末端连上GFP基因，随后将三个基因的嵌合体注射到斑马鱼的胚胎细胞中，使所有的鱼体细胞都包含有这种融合基因，从而建立起了白血病模型。Langenau等的结果表明所有携带有功能性c-Myc基因的鱼都会产生肿瘤。由于斑马鱼的皮肤透明 ,研究人员可以比较容易地观察到带有绿色荧光的白血病细胞的扩散情况：它首先出现在胸腺(胸腺与免疫系统的发育有关 ) ，随后逐渐扩散到胸腺附近的腮和眼睛后面的组织，进而再步扩散至骨骼肌和腹部器官。斑马鱼白血病模型的建立时的研究人员更容易弄清楚究竟是什么原因加快和减缓了急性成淋巴细胞白血病（ALL）的进展，并为更快速、更直接的检验和药物治疗提供了方便的研究评价模型。该模型的建立将会对对其他各种人体肿瘤模型的建立有很大的启示作用，将会促进其他的人体肿瘤模型的建立。
近年来，借鉴果蝇、小鼠“饱和诱变”筛选突变体的策略，通过利用ENU、γ或X射线照射、以逆转录病毒为载体的插入诱变等办法，尤其是ENU化学诱导法，可以得到大量发生的单基因突变斑马鱼。目前，已有许多大规模的突变体筛选计划正在斑马鱼中进行，数千种各式各样的组织发育异常突变体已经被筛选出来。由于斑马鱼独特的体外透明胚胎发育过程，使得人们对胚胎的获得、突变体表型的观察极为方便和高效。比如，哈佛大学医学院的Leonard I Zon教授所领导的课题组就已经成功筛选出50多种影响红系造血功能的突变体斑马鱼。这些不同类型的突变表型涉及斑马鱼造血的各个阶段：有的不能造血，有的是造血祖细胞分化受阻，有的是造血前体细胞增殖受阻，有的是光敏性血液病，有的是低色素……在这些特定表型中，有许多和人类的某些先天性贫血 、地中海贫血非常相似。以这些斑马鱼模型为基础，采取定位克隆策略，有学者已经鉴定出了一种与血色素合成有关的关键基因ALAS-2。在人类中，ALAS-2基因突变可引起X连锁的铁粒幼红细胞性贫血。此外，还有学者利用斑马鱼发现了一个编码铁转运蛋白的新基因，该基因突变可导致肠道内铁的吸收障碍，引起低色素性贫血，而在人体中，该基因则与常染色体显性血色素沉着病有关。再者，斑马鱼的地中海贫血模型也已经被建立，并被证实与血红蛋白的一个基因作为有关。 四、与斑马鱼研究有关的几个网址
http://zfish.uoregon.edu/，是一个斑马鱼模式生物数据库，其长期目标是促进和支持斑马鱼遗传学、基因组和发育等相关信息的整合及加速斑马鱼作为人类科学研究模式生物的应
用。网站提供斑马鱼基因，基因图，基因变异，基因表达和进行斑马鱼研究的研究者和实验室信息。
http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg，是一个斑马鱼信息网，ZFIN作为斑马鱼研究的信息平台，旨在为研究者利用斑马鱼提供联机数据库资源，创建和支持斑马鱼遗传学基因组学及发育学综合性信息资源建设，维护确切的斑马鱼研究参考数据系统，建立该信息源与其他模型生物数据库和人类数据库的广泛链接，为使斑马鱼成为人类生物学研究的模型生物提供便利条件，满足研究团体的需求。
http://zebrafish.mgh.harvard.edu/ http://www.genetics.wustl.edu/fish_lab/ http://zebrafish.stanford.edu/ http://zfish.wustl.edu/ http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg
第五节 模式生物研究的现状与和趋势
一、模式生物基因组计划与比较基因组学
模式生物基因组计划是人类基因组计划的一个重要组成部分，是人类基因组计划的必要补充并对后者的研究有很大的促进作用。由于人类对自身理解的限制、实验的限制和伦理学的制约，医学、生物学的研究在很大程度上依赖于对一些模式生物的研究。在研究人类基因组的同时，平行地进行一些微生物、植物、动物等模式生物基因组的研究，不仅可为人类基因组研究做方法学和组织工作的积累，而且通过将从模式生物中所得到的数据和资料与人类基因组进行同源性比较，借以阐明人类相应基因的功能。因此，一些与人类基因具有相似性，但结构和基因组成都相对比较简单的生物体就成为进行人类基因组研究的绝好样本，即为人类基因组研究提供参照，对这些模式生物的基因组进行测序和分析，就是模式生物基因组计划。
1、模式生物基因组计划的内容
模式生物基因组计划最初确定的模式生物有：大肠杆菌、酵母、拟南芥、线虫、果蝇和小鼠等共六种，对这些处于生物演化不同阶段的生物体的研究是认识人基因组结构和功能绝对不可缺少的，在后来的发展中逐渐加入了其它一些模式生物种类，如河豚鱼、斑马鱼等。此外，一些具有重要生产价值的农作物，如水稻基因组等的研究也加入到模式生物基因组计划中来。随着人类基因组计划的不断深入，将会有越来越多的模式生物体加入到模式生物基因组计划中来。
表6-2 一些主要模式生物基因组研究概况
物 种 大肠杆菌 酿酒酵母 拟南芥菜 秀丽隐杆线虫 果蝇 小鼠
基因组大小（bp） 4.2×10 1.2068×10 1.0×10 1.0×10 1.2×10 3.0×10
9888
76
基因数目 4288 6000 25000 19099 13601 30000
测序完成年份 1997年9月 1996年10月 2000年12月 1998年12月 2000年3月 2003年12月
迄今至少已有5种真核生物（酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、小鼠和拟南芥菜）、38种微生物完成全基因组序列分析的基因组测序，对功能基因的研究也有所突破。其它的模式
生物基因组计划也进展顺利，斑马鱼的测序工作也行将结束。 2、模式生物基因组计划的应用前景
通过模式生物基因组计划的研究为人类基因组计划提供理想的实验系统，发展新的基因组研究方法和技术，这仅仅只是模式生物基因组计划的基本应用。
模式生物基因组计划最直接的应用体现在生物信息学领域。当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以迅速地到任何模式生物基因组数据库中检索与之同源的的功能已知的模式生物基因，并获得其功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能研究。
模式生物基因组计划在人类疾病（特别是多基因遗传性疾病）的预防、诊断、治疗以及新药的开发等方面也有广泛的应用前景。例如，人类遗传性非息肉性小肠癌相关基因与酵母的MLH1、MSH2基因，运动失调性毛细血管扩张症相关基因与酵母的TEL1基因，都有很高的同源性。
模式生物基因组计划自身研究成果的应用也将给人们的生产、生活带来了更深刻和广泛的影响。从80年代已经开始的对植物遗传物质的修饰已经和正在对人类社会产生愈益巨大的影响。例如，通过遗传修饰生产对某种除莠剂（如Roundup）具有抗性的大豆、棉花、油菜、土豆、玉米等的种子已经育成，而且通过了美国FDA严格的审查，开始在大田播种。美国孟山都公司的抗Roundup大豆在1996年种植了100万公顷，1997年上升到900万公顷，今年将达到2,000万公顷。该公司育成的抗棉铃虫棉花种籽也已经在我国北方大面积长期推广。今年全世界种植的基因组修饰的各种作物大约会超过2,500万公顷。 二、模式生物研究的趋势
由于利用模式生物研究发育和疾病显示的巨大优势和潜力，国外许多公司已注意采用这种策略来发展生物技术和制药产业。美国杰克逊实验室和橡树林国家实验室等在政府的大力支持下，投资5千多万美金进行小鼠的ENU化学诱变和疾病模型研究，英国国立医学研究院和德国GSF医学遗传学研究所等也投入巨资进行相类似的研究。美国Lexicon公司和Regeneron公司等正在构建各种基因失活的小鼠品系，用以筛选具有重要功能的基因。
在人类基因组计划的提前完成后，以模式生物为代表的解析基因功能的功能基因组学研究将成为下一步研究的重点。从整体上看，这类研究具有如下特点和趋势。
1、从表型出发的高通量筛选和从单一基因出发的转基因／基因剔除两种研究方法的综合运用
高通量筛选已经成为现代生物学的一个重要原则和发展趋势。在小鼠遗传学领域，运用表型鉴定的方法，筛选化学诱变或射线诱变的小鼠来建立人类疾病模型近年来已经在发达国家流行。例如，美、英、德、日、澳和加拿大等国先后建立了基于ENU诱变的大规模筛选中心，数以千计新的小鼠品系，模拟人类代谢性疾病、自身免疫疾病、老年性疾病和神经系统疾病的模型正在不断被建立起来，相关基因开始被克隆。随着基因组测序的完成，大量的染色体定位标志和基因组多态性被发现，将大大加快了从表型到突变基因的克隆速度。
传统的单一基因的转基因／基因剔除技术也同时在各实验室越来越普及，新的方法和手段也不断建立，特别是可诱变转基因小鼠和组织特异性基因剔除小鼠的建立，使分析特定基因在特定发育时空的功能成为可能，所以其在生物学研究中应用也将越来越广泛。 2．不同种类模式动物的综合利用
模式动物的综合利用也是目前疾病模型建立的趋势之一。线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等模式动物各有其优势。例如，线虫的细胞分化谱系明确，为研究细胞－细胞间相互作用和特定细胞功能提供了很好的模型，Brenner、Horvitz和Sulston利用线虫发现细胞凋亡调控的关键基因。果蝇的遗传背景清楚，基因定位与表型效应的关系明确，各种遗传分析方法也较成熟。斑马鱼通体透明，是研究器官发生的最佳材料之一，尤其是对心血管系统。当然，由于小鼠和人类的高度同源，更多的研究以小鼠为对象，从Snell通过小鼠的皮肤移植提出组
织相容性抗原概念到现代遗传学家通过小鼠基因组改造建立人类疾病模型和研究基因功能，小鼠研究已经一次次证明了其对生命科学发展的重要性及产生的重大影响。基于上述特点，研究者可以根据研究目的之不同，有机地进行模式生物的选择与组合搭配。 3、新的模式生物越来越多
实践已经证明，不同特色模式生物在生命科学研究中所扮演的重要作用，实践也必将证明其他一些具有一定特色生物的模式作用。比如，越来越多证据显示，水螅（hydrozoan）有可能是研究神经系统网络形成与作用机制的重要模式生物。由于鱼类普遍具有繁殖力强、体外产卵、体外受精、胚胎透明等特点，除斑马鱼外，青鳉（Oryzias latipes）、剑尾鱼（Xiphophorus）也已被日本和德国的学者选作模式生物。而红鳍东方豚（Fugu rubripes）也因其基因组只有人类的八分之一，亦被选作人类基因组计划的模式生物。目前，我国学者正在尝试对家蚕进行探索，尝试建立有中国特色的模式生物。纵观模式生物发展的历史进程，有理由相信，还会有更多的模式生物进入我们的研究视野。
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