逆转录环介导等温核酸扩增技术 (RT-LAMP) 在H5N1禽流感病毒

第２４卷第３期　病　毒　学　报　ＶｏＩ．２４　ＮＯ．３　２　０　０　８年５月　ＣＨＩＮＥＳＥ　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　０Ｆ　ＶＩＲ０Ｌ０ＧＹ　Ｍａｙ　２００８　逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ－ＬＡＭＰ）在Ｈ５Ｎ１禽流感病毒　基因检测中的应用　李启明　，马学军　，高寒春　，周蕊　，匡治州　，侯云德　（１．中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室，北京１０００５２；　２．北京金迪克生物技术研究所，北京１００１７６）　摘要：建立一种便捷、灵敏的检测方法，即逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ—ＬＡＭＰ）用于Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病　毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中８个基因区段的６条特异引物，在等温条件下进行核酸扩增反应。　对５１份实验感染动物及病毒培养标本的Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的ＨＡ、ＮＡ基因区进行了ＲＴ—ＬＡＭＰ检测，并以　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术，对该反应进行实时监控，经对扩增产物做内　切酶验证和测序分析，证明ＲＴ—ＬＡＭＰ技术的特异性；同时，用１Ｏ倍系列稀释的ＲＮＡ样品对该检测方法的灵敏度　进行了测试。结果显示：利用ＲＴ—ＬＡＭＰ技术成功检测到Ｈ５Ｎ１禽流感病毒的ＨＡ、ＮＡ基因区，且ＲＴ—ＬＡＭＰ与　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测１Ｏ个拷贝ＲＮＡ分子水平。因此，ＲＴ—　ＬＡＭＰ技术应用于Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。　关键词：Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒；逆转录环介导等温核酸扩增技术；实时监控　中图分类号：Ｒ３７３．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—８７２１（２００８）０３—０１７８—０７　逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ＿ＬＡＭＰ）　司，Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶购自ＮＥＢ公司，Ｂｅｔａｉｎｅ购自Ｓｉｇｍａ公　最初由Ｎｏｔｏｍｉ等人设计并应用于各种病毒及其它　司，ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，限制性内切酶Ｔａｑ　病原体基因的检测（具体原理参见文献）［１］。该技术　Ｉ，ＭｕｎＩ均为ＴａＫａＲａ公司产品，凝胶核酸回收试剂盒为　分别使用特异对应于靶序列中８个基因区段的３对　Ｑｉａｇｅｎ公司产品，Ｈ５Ｎ１亚型禽流感Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ试剂盒　特异引物，并在反转录酶和Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶的作用　为上海闪晶生物公司产品。Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的细胞　下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个检测反应　培养物与实验感染动物标本均由医科院动物所提供（有关感　染实验均在ＩＩＩ级生物安全实验室按国家标准操作）。　只需１．５～２．５　ｈ口　］。本文首次采用ＲＴ－ＬＡＭＰ技　２探针和引物设计　在ＧｅｎＢａｎｋ中分别下载Ｈ５Ｎ１亚型　术对Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的实验感染动物标本　禽流感病的ＨＡ和ＮＡ基因序列，导入ＡｌｉｇｎＸ软件中进行　和培养病毒样品进行了检测，对扩增产物作了内切　比对，选择保守区［５　］。在所选区域中借助软件设计相应的　酶验证和测序分析，并对这种方法的特异性和灵敏　ＲＴ—ＬＡＭＰ引物。所有探针、引物的合成修饰由上海生工和　度进行了进一步验证。同时，将这种方法与Ｒｅａｌ—　ＴａＫａＲａ公司完成，序列见表１。　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ及ＲＴ—ＰＣＲ技术作了平行比较和评估。　３　ＨＳＮ１亚型禽流感病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ检测　设计了一套实时监控实验方案，并通过实验阐述了　３．１　Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒ＨＡ基因区的检测　按试剂盒　核酸序列结构与ＲＴ－ＬＡＭＰ检测技术的反应动力　说明提取病毒ＲＮＡ。建立如下扩增反应体系：５“１　ＲＮＡ样　学的关系。　品、２．５｝ｌ１　Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶缓冲液（１０×）、１　１　Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合　酶（８Ｕ／｝ｌＬ）、１／１１　ＡＭＶ反转录酶（１０Ｕ／／￣Ｌ）、１　１　ｄＮＴＰ　（２５ｍｍｏｌ／￣Ｌ）、５　１　Ｂｅｔａｉｎｅ（５　ｍｏ１／　Ｌ）、１　１　ＭｇＳＯ４　材料与方法　（１００ｎｍｏｌ／￣ｕＬ）、对应于ＨＡ基因的六条引物各１“１（引物浓　度为Ｆ３与Ｂ３：５　ｐｍｏｌ／￣Ｌ、ＢＩＰ与ＦＩＰ：４０　ｐｍｏｌ／￣Ｌ、Ｌｏｏｐ一１　１材料　ＡＭＶ反转录酶、ｐＧＥＭ—Ｔ载体购自Ｐｒｏｍｅｇａ公　与Ｌｏｏｐ－２：２０　ｐｍｏｌ／ｔ￣Ｌ）、２．５“１　Ｈ２Ｏ。混匀，６５℃，水浴１．５　收稿日期：２００８—０４—０２；修回日期：２００８—０４—０７　２ｈ。１．５　琼脂糖凝胶电泳，观察结果。　基金项目：科技部禽流感防治重大专项（２００４ＢＡ５１９Ａ４７，　３．２　Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒ＮＡ基因区的检测　方法与　２００４ＢＡ５１９Ａ３４）　ＨＡ基因区的检测相同，使用的引物为对应于ＮＡ基因区的　作者简介：李启明（１９７３一），甘肃人，医学博士，主要从事分子病　六条特异性引物。　毒学研究。　通讯作者：马学军，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｘｉ２００４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ　３期　李启明等：逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ－ＬＡＭＰ）在ＨＳＮ１禽流感病毒基因检测中的应用　·１７９·　ＨＡ　ｆｏｒ　ＬＡＭＰ　Ｆ３　Ｂ３　ＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＣＣＡＣＴＴＡＴＴＴＣＣ　ＣＡＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣ　ＧＴＡＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣ　ＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＡＧＧＧ　ＣＧＴＴＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＧＣ　ＡＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣ　ＦＩＰ（Ｆ１＋Ｆ２）　ＢＩＰ（Ｂ１＋Ｂ２）　Ｌｏｏ￣ｌ　Ｌｏｏ￣２　４　ＲＴ－ＬＡＭＰ扩增产物的酶切鉴定和序列测定　４．１　内切酶鉴定对ＲＴ－ＬＡＭＰ扩增产物按以下对应关系　ＭｇＳ０４（１００ｎｍｏｌ／ｖＬ、对应的六条引物各１　１、０．７５　１　Ｈ２Ｏ。　混匀反应液，在普通Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪中进行荧光检测，６５　℃反应２ｈ，每２ｍｉｎ检测一次荧光值。　８利用ＲＴ－ＬＡＭＰ法检测Ｈ５Ｎ１禽流感病毒样本　用常规　进行限制性内切酶消化：ＨＡ－Ｔａｑ　Ｉ；ＮＡ－Ｍｕｎ　Ｉ，在各自适　宜温度的水浴中消化６ｈ，１．５％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。　４．２　序列测定　回收ＨＡ和ＮＡ基因的Ｒ　ＬＡＭＰ阳性产　物（２００ｂｐ左右的条带），并以此为模板进行普通ＰＣＲ扩增。　方法对收集的５１份ＨＳＮ１禽流感病毒实验感染动物标本进　行检测验证，同时与平行方法（ＲＴ—ＰＣＲ）的检测结果进行比　较。　扩增产物经回收、连接、转化，得到阳性克隆，测序。　５　ＲＮＡ样品的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ定量　Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病　毒核酸的定量按以下操作过程进行Ｌ１。　１ｊ：取出ＰＣＲ主反应　液、酶混合物和荧光探针，按ＰＣＲ主反应液：酶混合物：荧　光探针一８：６：１的比例混合，充分混匀后离心数秒，分装　至ＰＣＲ反应管中，每管１５　１，分别加入１５　１处理好标本的　模板，低速离心数秒以混匀，置于Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪上进行　监控。循环参数为：４８℃３０ｍｉｎ，９４℃２ｍｉｎ，９４＂Ｃ　３ｓ，５５℃　结　果　１　ＨＳＮ１亚型禽流感病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ检测　对Ｈ５ＮＩ亚型禽流感病毒ＲＮＡ样品进行了　ＲＴ—ＬＡＭＰ检测，图１显示了检测结果。阳性样品　的ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增结果（６、１２）中核酸电泳条带呈　１５ｓ，７２℃１５ｓ，９４℃３ｓ，６０℃４５ｓ，循环４５次。按照使用标准品　绘制的标准曲线求出检测样品的核酸拷贝数。　６　ＲＴ－ＬＡＭＰ在ＨＳＮ１禽流感病毒ＨＡ和ＮＡ基因检测中的　灵敏度测试取１份用ＴａｑＭａｎ法进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ定量　阶梯状分布，与理论结果相符。阴性（１、７）对照未见　特异性产物出现。为了验证这种检测方法的特异　性，在Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的ＮＡ和ＨＡ基因检　测中分别对乙型流感病毒（２、８）、ＨＩＮ１型流感病毒　（３、９）、Ｈ３Ｎ２型流感病毒（４、１０）和ＨＣＶ（５、１１）基　因做平行对照检测。在结果中这些对照病毒检测均　呈阴性，表明该检测方法具有较高的特异性。　２　ＲＴ－ＬＡＭＰ扩增产物的酶切鉴定和序列测定　后的Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病的核酸样品，进行１Ｏ倍系列稀释，　具体实验方案参照ＲＴ－ＬＡＭＰ的常规操作程序进行。同时，　取禽流感病毒ＲＮＡ的稀释样品进行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测作　为平行对照，对结果进行分析和比较。　７　ＲＴ－ＬＡＭＰ的实时监控及反应动力学研究　用１Ｏ倍系列　稀释的ＲＮＡ样品行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＬＡＭＰ，建立以下扩增反　应体系：５　ｌ　ＲＮＡ样品、２．５　１　Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶缓冲液（１０　×）、１　１　Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶（８Ｕ／￣Ｌ）、１　１　ＡＭＶ反转录酶　（１ＯＵ／　Ｌ）、１　１　ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／￣Ｌ）、１．２５　１　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　（２０×）、０．５　１６一ＲＯＸ（５０×）、５　１　Ｂｅｔａｉｎｅ（５ｐ．ｍｏｌ／ｐ．Ｌ）、１　１　图２显示了对Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的ＲＴ－　ＬＡＭＰ扩增产物限制性酶切分析结果，泳道３为　ＨＡ基因扩增产物经内切酶Ｔａｑ　Ｉ酶切后成为三条　主带（５８ｂｐ、１５０ｂｐ、１２２ｂｐ）以及少量不同长度的条　病毒学报24卷NA11AS2346M89l【JJI】2Mbp2(WM)10{X)7505002601fM}图1H5N1亚ure型禽流感病毒RTLAMP检测tectVFig1DeioUSnofAvianinfluenzaAH5N11iribyRTRNA9IAMP7RTLAMPithotv28RTLAMIwithAianinfluaBiRNA；3RTLAMPithAininflinfl图RFigure3eaHSNl亚型禽流感病毒的zaAH1N1iRNA410RTLAMPwithAialtimePCR定量标准曲线oAH3N2RNALAMP511_RTifluLAMPwithHCVRNA；612RT3SAvtanndardinflucurvefRealtimevPCRforithAvienAH5NliRNAiaenzaAH5N1irus带泳道6为NA基因扩增产物经内切酶(233bpMunI4RTLAMP消化后形成以两条带带型193bp)为主的电泳在HSNl禽流感病毒HA和NA基因以上分析结果均与理论值相符证明这种扩检测中的灵敏度测试图4增保持了较高的特异性测序结果表明扩增序列与96为RTLAMP在HSNl禽流感病毒HA设计使用序列的同源性达到％以上进步证实和NA基因检测中灵敏度的测试结果图中10拷了这种检测方法的高特异性和可行性HA贝以上的稀释度均显示了典型的LAMP扩增带型且信号依次递增说明该检测方法的灵敏度理论上NA～1-可达到大约10个拷贝的水平M图5显示了对l123M456HSNl禽流感病毒平行进行的ReatimePCR灵敏度测试结果结果说明R2tm(1HAlOI){175t)51)0251)(H)】ealtimePCR10在H5N1禽流感病毒检测中的灵敏度也达到了NA拷贝的水平12345f】789I)】1112图2H5N1亚型禽流感病毒RTLAMP产物的酶切分析nanaFigure2RestrictiocnenzymedigestiolysisvofsRTIAMPproduwtsofAAvianninfluenzaAH5N1HSNlviru124RTLAMPithoutiaiflzaAiRNA；；图4RTLAMP在病毒检测中的5RTLAMPoithAwiinflgaAH5N1digiRNA3灵敏度测试结果(110min)FigureRTLAMPp6dptithHAftgeetioithesTaqI；4TestofssensitivityofRTmLAMPwithRTLAMPunrodtwithNAnfterdigtiowith1virucgwenes(110tin)；MI7tRTLAMPpodutsithouRNA28RTLAMPprod3RNA样品的TaRanealtimePCR定量HSNl哑型with10oopiefRNA39R1pLAMPpwoductsith10pie。利用图qm法分别对5份Rea禽流感定量copifRNA5410RTLAMPpwdtithlOcof病毒的细胞培养样品进行了3ltimePCRRNA11RTLAMPduct0ith10oopiesfRNA；6列举了定量中使用的标准曲线12RTLAMPprodutsith10opiefRNA３期　李启明等：逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ　ＬＡＭＰ）在Ｈ５Ｎ１禽流感病毒基因检测中的应用　·１８１·　口　叠ｌａＱ　５　Ｒ￣ＬＡＭＰ的实时监控及反应动力学研究　利用普通Ｒｅａｌ—ｔｉ８　ｍｅ　ＰＣＲ仪分别对Ｈ５Ｎ１亚型　ｎ　６　４　２　Ｏ　彳＝ｍ　２　４　禽流感病毒ＨＡ和ＮＡ基因的ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增过　程进行了动态监控（图６），并以不同稀释度的Ｃｔ值　对扩增模板绘制了标准曲线（图７）。图６显示了　ＮＡ和ＨＡ基因不同稀释度的扩增曲线，动态监控　结果反映出对同一稀释度的样品中ＨＡ与ＮＡ基　因的ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增所需用的最佳时间并不相同，　如图中两个不同基因的最佳扩增时间可以相差　３０ｍｉｎ左右，所检测的最大荧光值也相差７～８倍，　说明ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增时间因扩增靶基因的不同而　图５　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ在Ｈ５ＮＩ禽流感病毒　不尽相同。在标准曲线中，三个稀释度的Ｃｔ值均能　检测中的灵敏度测试　分布于趋势线左右，证明Ｃｔ值与扩增初始模板的拷　Ｆｉｇｕｒｅ　５　Ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ　贝数之间存在良好的线性关系。　６利用ＲＴ－ＬＡＭＰ技术检测Ｈ５ＮＩ禽流感病毒样　太　－－＿■■．　’　强鬯　，１Ｉ　～　妻　”　—　◆＿ＮＡ１（１Ｅ＋６　ｃｏｐｉｅｓ）—－－ＮＡ２（１Ｅ＋５　ｃｏｐｉｅｓ）　＆ＮＡ３　ｆｌＥ　ｃｏｐｉｅｓ）一ＮＡ４（Ｎｅｇａｔｉｖｅ）　图６　ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增的实时监控　Ｆｉｇｕｒｅ　６　Ｒｅａｌ—－ｔｉｍｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｍｉｔｔｅｄ　ｂｙ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｉｎ　ＲＴ——ＬＡＭＰ　利用ＲＴ—ＬＡＭＰ技术对５１份Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病　毒细胞培养标本及实验感染的不同动物标本进行了　检测，结果统计见表２。其中有３份被半巢式ＰＣＲ　和ＲＴ—ＰＣＲ检测为阴性的咽拭子样品被ＲＴ—　ＬＡＭＰ检为阳性，估计是因巢式ＰＣＲ中的ＲＮＡ酶　污染所致。　讨　论　１扩增区基因的选择和引物设计　图７　Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　目前大多数Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒的基因检　ＬＡＭＰ标准曲线　测中都选用ＨＡ基因区，文中同时将ＨＡ和ＮＡ基　Ｆｉｇｕｒｅ　７　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　Ｒｅａｂｔｉｍｅ　ＬＡＭＰ　因区作为检测对象，便于在检测中相互印证以提高　ｆｏｒ　Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ　１８２　·　病　毒　学　报　特异性。在基因保守区的选择中，选择了Ｈ５Ｎ１亚　期，利用这两套引物只能扩增在Ｈ５Ｎ１亚型禽流感　型禽流感病毒特异的ＨＡ和ＮＡ基因保守区，所选　择的两段区域相对于其它亚型禽流感病毒的同源率　分别是ＨＡ约为７８　，ＮＡ约为７５　。按照设计预　病毒中的ＨＡ和ＮＡ基因，除此之外的其它亚型流　感病毒中的ＨＡ５或ＮＡ１基因并不能被扩增。　表２　ＨＳＮ１亚型禽流感病毒样品的Ｒ￣ＬＡＭＰ检测结果　Ｔａｂｌｅ　２　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ＲＴ－ＬＡＭＰ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＼　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　１０　ＲＴ—ＰＣＲ　ＮＤ　５　Ｓｅｍｉ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ＮＤ　６　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ｆｏｒ　ＮＡ　１０　６　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ｆｏｒ　ＨＡ　１０　６　ＳａｍｐｌｅｓＣｕｌｔｕｒｅｄ　ｖｉｒｕｓ（ｎ一１０）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　Ｔｈｒｏａｔ　ｓｗａｂ　ｏｆ　ＮＤ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｍｏｎｋｅｙ（ａｍ６）　Ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ＮＤ　５　１４　１４　１４　（ｎ一１６）　Ｔｈｒｏａｔ　ｓｗａｂ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ（ｎ一１９）　ＮＤ　０　３　６　６　２　ＲＴ—ＬＡＭＰ灵敏度测试　ＬＡＭＰ扩增产物的测序结果与设计时所选用的基　因序列基本吻合，同源率分别是ＨＡ为９８　，ＮＡ　为９６　，这进一步验证了这种检测技术的高特异　性。　４　ＲＴ－ＬＡＭＰ的实时监控　目前所有利用ＲＴ—ＬＡＭＰ技术进行ＲＮＡ检测　的报道中，其灵敏度测试大多使用人工合成的模式　ＲＮＡ分子，本文在灵敏度测试中使用了临床样品进　行验证。在Ｈ５Ｎ１禽流感病毒ＨＡ和ＮＡ基因的　检测中其灵敏度均可达到１０个拷贝分子的水平，这　与文献报道中最少可检测６个拷贝模式ＲＮＡ分子　利用核酸染料ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ可以特异地嵌入　双链核酸的特性进行了ＲＴ＿ＬＡＭＰ扩增反应的全　的灵敏度相近。当然，由于反转录效率的影响因素　很多，１０个拷贝ＲＮＡ分子的检测灵敏度只是依据　实验结果的一种理论推断。在文中也同时利用一份　相同的Ｈ５Ｎ１禽流感病毒的ＲＮＡ样品与Ｒｅａｌ—　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）方法进行了灵敏度的平行比　较，结果证明这两种方法在Ｈ５Ｎ１禽流感病毒检测　中的灵敏度相近。　３　ＲＴ·ＬＡＭＰ特异性测试　程实时监控，用自动设定临界值的方式由Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪给出的Ｃｔ值与ＲＮＡ的拷贝数之间存在较　好的线性关系，因此，这种方式不但可以实时监控，　也可以进行模板核酸的定量。这些结果均证明了这　种实时监控方法是有效的。　５基因结构与扩增反应动力之间关系的推测分析　分析ＲＴ—ＬＡＭＰ扩增的全程实时监控的结果　不难看出，选择不同的基因扩增区和引物虽然均能　达到理想的灵敏度，但扩增所需的最佳时间有着很　在特异性测试中，本文分别使用了三种方法进　行验证。首先在检测中使用其它亚型（Ｈ３Ｎ２，　ＨＩＮ１，Ｂ型）或相关病毒作交叉测试＿ｌ　”］，均达到　了满意的效果。交叉测试中，虽然使用了ＨＩＮ１型　流感病毒，而在结果中这型病毒的ＮＡ基因检测为　大的差异。例如，禽流感病毒扩增所需的最佳时间　的ＨＡ与ＮＡ之间就相差近３０　ｒａｉｎ。究其原因，推　测是由于逆转录效率的高低不同所致。通过ＲＮＡ　结构可能预测软件进行了扩增基因区的ＲＮＡ结构　分析，发现ＮＡ基因扩增区中存在很稳定的二级结　构，这些结构的自由能是ＨＡ基因扩增区中二级结　构的近两倍（５１．５／２９．９），与我们的推论正好吻合，　成为这个推论的有力证据。这也是对ＲＴ—ＬＡＭＰ　技术资料的有益补充，对ＲＴ—ＬＡＭＰ技术今后的发　阴性反应。这与最初设计相符，也证明基因的同源　率在７５　以上时就能满足ＲＴ—ＬＡＭＰ的特异性要　求。其次，文中又对ＨＳＮ１亚型禽流感病毒的　ＬＡＭＰ扩增产物进行了相应的内切酶消化鉴定。　由于产物是各种复杂的核酸聚体，尽管所选择的内　切酶在设计基因区中都是单切点，但最终的消化产　物在电泳结果中均是由多条带形组成，这些电泳带　与设计时预期计算的大小完全吻合，证明这种扩增　是特异的。并且Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒基因　展应用提供了较为可靠的实验室经验。　综上所述，ＲＴ—ＬＡＭＰ检测技术省略了单独的　逆转录和ＲＴ—ＰＣＲ的二次扩增，且反应在等温条件　下进行，没有核酸的变复性过程，既节省了时间又减　３期　李启明等：逆转录环介导等温核酸扩增技术（ＲＴ—ＬＡＭＰ）在Ｈ５Ｎ１禽流感病毒基因检测中的应用　·１８３·　少了ＲＮＡ酶和扩增核酸的污染机会。更重要的　是，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列　中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这　些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，使　检测特异性得到改善。ＲＴ—ＬＡＭＰ是一种便捷、特　［６］Ｓａｗ　Ｔ　Ａ，Ｌｉｍ　Ｗ，Ｓｈｏｒｔｒｉｄｇｅ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｖｉ—　ａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ（Ｈ５Ｎ１）ｖｉｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎｓ－Ｈｏｎｇ　Ｋｏｎｇ，Ｍａｙ－Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９９７［Ｊ］．ＭＭＷＲ　Ｍｏｒｂ　Ｍｏｒｔａｌ　Ｗｋｌｙ　Ｒｅｐ，１９９７，４６：１２０４－１２０７．　［７］Ｔｒａｎ　Ｔ　Ｈ，Ｎｇｕｙｅｎ　Ｔ，Ｎｇｕｙｅｎ　ＴＤ，ｅｔ　ａ１．Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕ—　ｅｎｚａ　Ａ（Ｈ５Ｎ１）ｉｎ　１０　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖｉｅｔｎａｍ［，Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，２００４，３５０：ＩＩ７．９一Ｉ７８８．　异而又灵敏的基因检测技术，进一步优化、完善后将　可能在遗传病和传染病的早期诊断方面有一定应用　潜力。　（致谢：本课题的中的样品由中国医学科学院实　［８］Ｃｈｏｔｐｉｔａｙａｓｕｎｏｎｄｈ　Ｔ，Ｌｏｃｈｉｎｄａｒａｔ　Ｓ，Ｓｒｉｓａｎ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．　Ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ（Ｈ５Ｎ１）一Ｔｈａｉｌａｎｄ，２００４ｉ－Ｊ］．ＭＭ—　ＷＲ　Ｍｏｒｂ　Ｍｏｒｔａｌ　Ｗｋｌｙ　Ｒｅｐ，２００４，５３：１００—１０３．　验动物研究所秦川教授提供，特在此表示衷心感　谢。）　参考文献：　［－１］Ｎｏｔｏｍｉ　Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ　Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｏｐ－ｍｅ—　ｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ［Ｊ］．Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２０００，２８：Ｅ６３．　［２３　Ｎａｇａｍｉｎｅ　Ｋ，Ｈａｓｅ　Ｔ，Ｎｏｔｏｍｉ　Ｔ．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｌｏｏｐ　ｐｒｉｍｅｒｓ［－Ｊ￣．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ，２００２，１６：２２３—２２９．　［３３　Ｎａｇａｍｉｎｅ　Ｋ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｏｈｔｓｕｋａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｏｐ－ｍｅ—　ｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｎｏｎｄｅｎａ－　ｔｕｒｅｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ［，Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，２００１，４７：１７４２—１７４３．　ｒ　４３　Ｍｏｒｉ　Ｙ，Ｋｉｔａｏ　Ｍ，Ｔｏｍｉｔａ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｔｕｒｂｉｄｉｍ—　ｅｔｒｙ　ｏｆ　ＬＡＭＰ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈ　Ｍｅｔｈ，２００４，５９：１４５—１５７．　［５］Ｖｉｓｅｓｈａｋｕｌ　Ｎ，Ｔｈａｎａｗｏｎｇｎｕｗｅｃｈ　Ｒ，Ａｍｏｎｓｉｎ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈ５　Ｎ１　ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎ—　ｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ａｍｏｎｇ　ｐｏｕｌｔｒｙ　ｐｏｐ—　ｕｌａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｔｈａｉｌａｎｄ［，Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，３２８：１６９—１７６．　［９３　Ｍｕｎｃｈ　Ｍ，Ｎｉｅｌｓｅｎ　Ｌ　Ｐ，Ｈａｎｄｂｅｒｇ　Ｋ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ（Ｈ５　ａｎｄ　ＨＴ）ｏｆ　ａｖｉａｎ　ｔｙｐｅ　Ａ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉ－　ｒｕｓ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ＥＬＩＳＡ［Ｊ］．　Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，２００１，Ｉ４６：８７—９７．　［１Ｏ］Ｋｗｏｋ　Ｓ，Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｒ．Ａｖｏｉｄｉｎｇ　ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ［，Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３９：２３７—２３８．　［１１３　Ｗａｒｄ　Ｃ　Ｌ，Ｄｅｍｐｓｅｙ　Ｍ　Ｈ，Ｒｉｎｇ　Ｃ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｓ—　ｓａｙｓ　ｆｏｒ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ｖｉｒａｌ　ｌｏａｄ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，［Ｊ］．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｖｉｒｏｌ，２００４，２９：Ｉ７９—１８８．　［１２］Ｃｏｏｐｅｒ　Ｌ　Ａ，Ｓｕｂｂａｒａｏ　Ｋ．Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇ—　ｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ－ｂａｓｅｄ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｈａｔ　ｃａｎ　ｄｉｓ—　ｔｉｎｇｕｉｓｈ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｈ１　Ｎ１，Ｈ３Ｎ２，　ａｎｄ　Ｈ５Ｎ１　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ｖｉｒｕｓｅｓｉ－Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２０００，３８：２５７９—２５８３．　［１３３　Ｓｐａｃｋｍａｎ　Ｅ，Ｓｅｎｎｅ　Ｄ　Ａ，Ｍｙｅｒｓ　Ｔ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐ—　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｙｐｅ　Ａ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｉａｎ　Ｈ５　ａｎｄ　Ｈ７　ｈｅ—－　ｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，４０：　３２５６—３２６０．　１８４　·　病　毒　学　报　２４卷　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆ０ｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｖｉａｎ　Ｉｎｆｌ　ｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　Ｖｉｒｕｓ　ＬＩ．Ｑｉ—ｍｉｎｇ　，ＭＡ　Ｘｕｅ—ｊｕｎ　，ＧＡＯ　Ｈａｎ－ｃｈｕｎ　，ＺＨＯＵ　Ｒｕｉ　，ＫＵＡＮＧ　Ｚｈｉ—ｚｈｏｕ　，ＨＯＵ　Ｙｕｎ－ｄｅ　，　（１．Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５２，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｊｉｎｄｉｋｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１７６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—　ＬＡＭＰ）ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔＯ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｎｅｗ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ａ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｓｉｘ　ｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｔｈａｔ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｅｉｇｈｔ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｕｎｄｅｒ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｎ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ，ｆｉｆｔｙ－　ｏｎｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ａｎｉｍａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｔｈａｔ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｔｅｓｔｅｄ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＲＴ—　ＬＡＭＰ　ｆｏｒ　ＮＡ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＨＡ　ｇｅｎｅ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ＬＡＭＰ　ｗａｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｉｎ　ｒｅ—　ａｌ—ｔｉｍｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ｄｙｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｇｈ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ—ＬＡＭＰ．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｒｉａｌ　１０一　ｆｏｌｄ　ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ｔｈｅｏ—　ｒｅｔｉｃａｌｌｙ　ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　１０　ＲＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｔｈｕｓ，ｗｅ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＲＴ—ＬＡＭＰ　ａｓｓａｙ　ｈａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｖｉａｎ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　Ｈ５Ｎ１　ｖｉｒｕｓ；Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａ—　ｔｉｏｎ；Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＭＡ　Ｘｕｅ－ｊｕｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａ　２００４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ