(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103710338 A(43)申请公布日 2014.04.09
(21)申请号 201310744462.X(22)申请日 2013.12.30
(71)申请人湖南圣湘生物科技有限公司
地址410012 湖南省长沙市高新技术产业开
发区麓松路680号(72)发明人戴立忠 唐瑶 吴康 邓中平(74)专利代理机构北京聿宏知识产权代理有限
公司 11372
代理人吴大建 刘华联(51)Int.Cl.
C12N 15/10(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)
权利要求书1页 说明书3页权利要求书1页 说明书3页
(54)发明名称
一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒(57)摘要
本发明提供一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，且所述红细胞裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。本发明解决了现有全血核酸提取试剂盒的缺陷，提供一种操作快速简单、提取效率高、使用安全、制造成本低的人类全血白细胞中DNA快速提取试剂盒。应用该试剂盒，可以对用于PCR技术检测的临床全血样本白细胞中DNA进行快速提取，提取得到全血中的白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。CN 103710338 ACN 103710338 A
权 利 要 求 书
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1.一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，且所述红细胞裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在所述红细胞裂解液中，所述氯化钠的浓度为5mmol/L，所述曲拉通100的浓度为1.0%（v/v），所述葡萄糖的浓度为320mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.01mol/L，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述红细胞裂解液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～8.4，更优选8.2。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包含0.6～1.0mol/L的氯化钾，0.4～0.8mol/L的乙二胺四乙酸，0.8～1.2%（m/v）的十二烷基硫酸钠，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述DNA提取液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～8.4，更优选8.2。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。
5.一种如权利要求1～4中任意一项所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤，步骤A，去除红细胞：向全血中加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，得到混合物，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物；
步骤B，提取白细胞中DNA：向步骤A中所得白色沉淀物中加入所述DNA提取液，用移液器吹打混匀，静置使白细胞充分裂解而释放出其中的DNA，得到用于PCR扩增的DNA溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，重复步骤A两次；即对步骤A中的白色沉淀物再加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，使沉淀重新悬浮而得到混合液，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤A中全血体积在100微升以上，且全血与红细胞裂解液的体积比为1：1～5。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤A中离心分离的转速为10000～13000转/分钟，离心分离的时间为1～3分钟。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，步骤A中全血与步骤B中DNA提取液的体积比为1：0.25～1。
10.权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒在荧光PCR检测技术中的应用。
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CN 103710338 A
说 明 书
一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒。
背景技术
自PCR技术在上世纪八十年代问世以来，其在分子生物学相关领域的应用越来越
广泛。尤其是近年来，随着人们对临床诊断精度灵敏度要求的提高，以及个体化医疗概念的提出和推广，PCR技术凭借其在临床诊断中快速、敏感、特异等优点，已经迅速广泛的应用到了临床诊疗，通过检测患者样本中的基因，从而帮助医生确定用药和治疗方案。[0003] 而样本DNA提取是PCR技术运用的前提，人类外周血在人体内免疫反应及代谢中发挥着重要作用，可用于血液系统及其他众多系统疾病的分子监测，由于其在临床上取样简单易得，在临床诊断或研究中应用最为广泛。
[0004] 目前全血DNA提取方法主要有苯酚-氯仿法、离心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作复杂且含有大毒性的有机溶剂已少有使用；离心柱法仍然是目前使用最广泛的全血DNA提取方法，但其需要特殊的硅胶膜层析柱，且需要反复的离心清洗后才能洗脱获得DNA；磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脱获得DNA；这些方法操作过程中需要多次离心、换管、磁棒分离过程，操作复杂，提取时间较长，对操作要求较高，不利于临床诊疗或研究应用。[0005] 目前国内外已有多种用于全血基因提取的试剂盒可以应用于临床。这些试剂盒所提供的全血DNA提取方法有很多缺点：如DNA提取过程复杂，样本处理耗时长；处理时，样本中的DNA存在不同程度的耗损，尤其对于高浓度样本，裂解不充分，富集不完全，造成DNA丢失而使样本定量偏低；处理步骤多，需要多次开盖换管、离心、漂洗多次，磁棒分离过程，易造成样本间交叉污染和环境气溶胶污染。提取过程需要多种仪器或特殊器材，制造成本较高，对操作要求高。
[0002]
发明内容
本发明的目的是提供一种人类全血DNA快速提取试剂盒及其从人类全血白细胞中提取DNA的方法，解决现有全血核酸提取试剂盒的缺陷，提供一种操作快速简单、提取效率高、使用安全、制造成本低的人类全血白细胞中DNA快速提取试剂盒。应用该试剂盒，可以对用于PCR技术检测的临床全血样本白细胞中DNA进行快速提取。[0007] 因此，本发明提供一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，且所述红细胞裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。[0008] 优选的，在所述红细胞裂解液中，所述氯化钠的浓度为5mmol/L，所述曲拉通100的浓度为1.0%（v/v），所述葡萄糖的浓度为320mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.01mol/L，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述红细胞裂解液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～8.4，更优选8.2。
[0006]
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CN 103710338 A[0009]
说 明 书
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在本发明一种具体实施方式中，所述DNA提取液包含0.6～1.0mol/L的氯化钾，
0.4～0.8mol/L的乙二胺四乙酸，0.8～1.2%（m/v）的十二烷基硫酸钠，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述DNA提取液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～8.4，更优选8.2。
[0010] 在本发明的另一种具体实施方式中，所述DNA提取液包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。[0011] 本发明还提供一种如上所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤，步骤A，去除红细胞：向全血中加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，得到混合物，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物；步骤B，提取白细胞中DNA：向步骤A中所得白色沉淀物中加入所述DNA提取液，用移液器吹打混匀，静置使白细胞充分裂解而释放出其中的DNA，得到用于PCR扩增的DNA溶液。
[0012] 在上述方法中，优选地，重复步骤A两次；即对步骤A中的白色沉淀物再加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，使沉淀重新悬浮而得到混合液，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物。[0013] 优选地，步骤A中全血体积在100微升以上，且全血与红细胞裂解液的体积比为1：1～5。优选步骤A中离心分离的转速为10000～13000转/分钟，离心分离的时间为1～3分钟。
[0014] 优选地，步骤A中全血与步骤B中DNA提取液的体积比为1：0.25～1。[0015] 本发明还提供一种如上所述的试剂盒在荧光PCR检测技术中的应用。[0016] 本发明的试剂盒中含有独特的红细胞裂解液，其使得全血样本中的红细胞特异性裂解，分离出全血中的有核细胞；再在DNA提取液的作用下得到全血中的白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。通过使用本发明中的试剂盒，能极大地避免提取过程中DNA的损失，大大增加了全血DNA的提取效率；本发明使用较少的操作步骤，减少管间交叉污染和对环境的污染；本发明提取步骤简单，无需加热，仅需进行一次或两次离心去除上清液，再加入DNA提取液，即可完成整个提取，大大缩短了提取时间，有利于临床诊断工作效率的提高。本发明的试剂盒制造成本低廉，无需特殊物料或仪器，仅需离心机和移液器，使用安全。本发明能同时抑制Dnase和Rnase活性，且对后续实验不产生影响。本发明的提取效率高于常见全血DNA提取方法。
具体实施方式[0017] 实施例1[0018] 1、人类全血白细胞中DNA提取试剂盒及其中试剂的配制方法：[0019] ①红细胞裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，称取并加入使浓度最终为5mmol/L的氯化钠，加入体积比最终为1%的曲拉通溶液，加入最终浓度为320mmol/L的
充葡萄糖，加入最终浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷；加入无菌水定容至所需体积，
分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.2；高压灭菌10分钟。[0020] ②DNA提取液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，称取并加入使浓度最终为0.8mol/L的氯化钾，加入最终浓度为0.6mol/L的乙二胺四乙酸，加入最终浓度为1%的十二烷基硫酸钠（质量体积比）；加入无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐
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说 明 书
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酸溶液调节pH值至8.2；高压灭菌15分钟。[0021] 2、试剂盒的应用：
[0022] 试剂盒的应用对象为100例全血样本。应用的具体操作步骤为：向每例200微升全血中加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀10秒，得到红色透明清亮混合物；对上述混合物进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为1分钟，去上清，留白色沉淀物；在上述沉淀物中再加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀，使沉淀重新悬浮而得到混合液；对上述混合液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为1分钟，去上清，留白色沉淀物；向所述沉淀物中加入100微升DNA提取液，用移液器吹打混匀数次，静置10分钟，使白细胞充分裂解，释放出DNA，得到可用于PCR扩增的DNA溶液。[0023] 3、对试剂盒应用的效果检测和评价：
[0024] 使用β-Actin管家基因检测试剂对上述DNA溶液进行检测。结果是，采用本发明中的试剂盒提取100例全血样本DNA后检测其中的β-Actin管家基因，100例均有扩增曲线，说明本发明提供的试剂盒能有效提取得到全血样本中白细胞的DNA。[0025] 另外，本发明的试剂盒与现有技术中的商售离心柱法提取试剂盒对同一全血样本进行DNA提取，用β-Actin管家基因检测试剂盒检测结果显示，对同样100例样本进行处理本发明较离心柱法节约2小时，且提取的检测结果靠前1-4个Ct，可见本发明的试剂盒较离心柱法操作更简便，且有更高提取效率。[0026] 实施例2[0027] 1、人类全血白细胞中DNA提取试剂盒及其中试剂的配制方法：[0028] ①红细胞裂解液的配制：同实施例1。[0029] ②DNA提取液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，称取并加入使浓度最终为0.1mol/L的氯化钾，加入最终浓度为0.2mmol/L的莎梵婷（surfactin），加入最终浓度为0.5%的十二烷基磺酸钠（质量体积比）和加入最终浓度为0.2%的乙醇；加入无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.2；高压灭菌15分钟。[0030] 2、试剂盒的应用：
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[0031] 试剂盒的应用对象为含EB病毒DNA浓度为1×10IU的全血样本。应用的具体操作步骤为：向200微升全血中加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀10秒，得到红色透明清亮混合物；对上述混合物进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为1分钟，去上清，留白色沉淀物；在上述沉淀物中再加入800微升红细胞裂解液，充分震荡混匀，使沉淀重新悬浮而得到混合液；对上述混合液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心分离时间为1分钟，去上清，留白色沉淀物；向所述沉淀物中加入50微升DNA提取液，用移液器吹打混匀数次，静置10分钟，使白细胞充分裂解，释放出DNA，得到可用于PCR扩增的DNA溶液。[0032] 3、对试剂盒应用的效果检测和评价：
[0033] 使用商售的EB病毒核酸定量检测试剂盒对上述DNA溶液进行检测。结果是，采用本发明中的试剂盒6次重复提取全血样本DNA后检测其中的浓度为1×104IU的EB病毒DNA，从扩增曲线看，基线平整，指数区明显，同一样本6次检测的Ct值的变异系数<2%，浓度变异系数<50%，重复性好。说明本发明提供的试剂盒能够有效收集到白细胞中的病毒DNA。
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