新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定

第２４卷　第２期　中　国预防兽医学报　Ｖｏ１．２４，Ｒｏ．２　２　０　０　２年３月　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　Ｖｅｔｅｒｌｎａ￣＇Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｍａｒ．２ｏＤ２　新城疫病毒山东强毒株的分离鉴定　沈志强，刘吉山，李峰，林初文，徐可利　（ａｓ　省淀州畜牧兽医研究所ｆｉｌ市省畜禽用蚌腔疫苗研究开发推广中心．山东藻州２５６６ｔｇ）　摘要：从山东流行烈性传染病的鸡群中分离出７株具有血凝活性的病毒，设７株病毒的血凝活性均能被新城疫Ｌａ　Ｓｏｔａ株　标准阳性血清所抑制．但病毒不能被中和．仍能致死鸡胚。经分离鉴定，分离毒均为新城疫病毒株。通过鸡胚半数致死量　（Ⅱ　。）、最小致死量致死鸡胚的平均时问０ｒｅ）Ｔ）、１日龄雏鸡脑内致死指数（ＩＣＰＩ）、６周龄雏鸡静脉致死指数（Ⅳｍ）、血凝解脱　及血凝素稳定性等试验表明：７株分离病毒均为新城疫病毒强毒株，其毒力与标准强毒株　株相似。　关键词：新城疫病毒；强毒株；分离鉴定　中国分类号：￥８５２　６５；　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８－０５８９（２００２）０２－０１３０－０３　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ珈曲Ｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ＳＨＥＮ丑　—ｑ￣ａｎｇ．ＬＩＵ　Ｊｉ—ｓｈａｈ，ＬＩ　Ｆｅｎｇ，ＬＩＮ　Ｃｈｕ－ＷＣＩｌｔ，ＸＵ　Ｈ　（Ｓｈ￣ｌｄ，ｍｇ　ＢｉｎＢ￣ｃｕ？ｍｉｍａｌ　Ｓｃｉｍ￣＆Ｖｅｔｅｒｌｎａｒ／Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［ｎ￣ｉｔｕｔｅ　２５６６１８．ｃｈｉ￣）　Ａｂｓ　ｒａｄ：７　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｒｔｔｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉ舯ｌ越ｅｄ　ｆｒｏｆｉｔ　７　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｆｌｏｅｋｓ　ｗｉ出￣ｔｉｇｈ　ｒｎｅｒｂｉｉｄ￣ａｎｄ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｅｏｔａｇｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｓｅ　ｉｓ０ｌａｂ　ａ工ｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ａｇｇｌｕｎｎｍｅ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｒｅｄ　ｂｌ￣ｘｘｔ　ｃｅｌｌ　ｗｈＪｃｈ　０ａｌｌ　ｂｅ　ｉｔ￣ｄｂｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｎｅｗｃａｓｄｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｔｒｓ　Ｌａ　Ｓｏｔａ　ｓｔｒａｉｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｎｌＪａｅｒａ．ｂｕｔ　ｃ盯ｍ０‘ｂｅ唧．　ｔｒａｌｉｚｅｄ　ｓａｅ　ａｒｔｉｆｓｅｒａ，出ｅｖ　ｗｅｒｅ　ｓｔｌｉｌ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｋｉｌｌ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｍｂ￣ｏｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｉｓｏｌａｔｍ　ｗｅｒｅ．ｃｍ￣ｎｎｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　１％ｗｅａｓｄｅ　ｄｌｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　５０％　ｅｍｂ￣ｏｌｅｔｈａｌ　ｄｏｓｅｌＥⅡ　ｊ，ｆｆｌｅａ］ｌ　ｄｅａｔｈｔｉｍｅ（ＭＥＴ）ｏｆ　ｃ￣ｃｋｅｎ　ｅｍｂ￣ｏｓ．ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｄｅｘ（ＩＣＰＩ）ｉｎ１－ｄａｙ－ｏｌｄ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ，ｉｎ—　ｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｐａｔｈｏｇｅａｌｃｉ￣ｉｎｄｅｘ（ＩＶＰＩ）ｉｎ　６－ｗｅｅｋ一０Ｉｄ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ，ｄｅｈａｅｔ￣ｒａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈａｅ呻　ｕ　ｎ　ｈｅａｔ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．１ｋ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　．ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｉ￣ｌｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｖｌａｑ１］ｅｎｔ　Ｎｅｗｃａｓｄｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｎ　，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ￣ｉｎｔｌｅｎｔ日ｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ａｓ　Ｅ９　ｓｔｒａｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｅ＇，，，，ｅａｓｆｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒａｓ；Ｈｉ　ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｔａｉｉｆ．ｃａｔｉｏｎ　自１９９７年冬季　来在全国部分省市的鸡群中　株）、淄博（７号株）等地的发病鸡群的肝脏、脾脏及肺　流行一种以呼吸道、消化道牯膜出血为典型症状的　脏　其中，滨州（１号株）和Ｂ照株（３号株）的病料采　急性传染病．使养鸡业受到极大损失。卒病临床上　自大批发病死亡的成年鸡群，淄博株（７号株）采自　主要表现以下几个症状：（１）引起３０～５０日龄的幼　引起成年鸡群产蛋率大幅大降的鸡群，其他采自大　鸡和成年鸡群大批发病，本病传播迅速．３～５天即　批发病死亡的３Ｏ～５０日龄的幼鸡鸡群。　可波及全群，发病率５０％～１００％，死亡率高达３Ｏ％　１．２新城疫标准强毒Ｆ蝈。购自中国兽药监察所。　～９０％。（２）引起成年鸡群产蛋率大幅下降，可下降　１．３新城疫ｔａ　Ｓｏｔａ株标准阳性血清本所自制，　７０％以上　（３）后期部分患鸡出现神经症状，抗菌素　通过日本太耳白兔制备标准阳性血清５６℃水浴灭　和化疗药物治疗无效　为尽快确诊此病，我们进行　活３０分钟ＨＩ：２　。　了病毒分离鉴定，并提出了有效地防制对策。现报　１．４　ＳＰＦ种蛋购自山东省农科院家禽研究所，９　告如下。　～ｌ０日龄普通鸡胚：购自山东省六一农场。　１．５　１％鸡虹细胞悬液、生理盐水按常规自制。　１材料和方法　１．６复合新城疫蜂胶灭活疫苗本所自制。　Ｉ　ｌ病料采自滨州（１号株）、潍坊（２号株）、日　１．７病毒分离培养　照（３号株）、聊城（４号株）、济南（５号株）、东营（６号　１．７．Ｉ病料处理：取采集的病死鸡的肝脏、脾脏、　肺脏用研钵分别研碎．加入３～５倍的灭菌生理盐水　作者简介：沈志强，男，山东省滨州畜牧兽医研究所研究　后加入终浓度为２Ｃ００１Ｕ／ｍｌ的双抗（青、链霉素最终　员，主要从事预防兽医学与生物制品学的研究　浓度各２０００１Ｕ／ｍ１），放置冰箱中过夜，备用Ｌ２】。　收稿日期：２００１—０３—１５　１．７．２病毒培养：取９—１０日龄健康鸡胚，将上述　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　沈志强，等．新城疫病毒山东强毒林的分离鉴定　被处理的病料，接种于鸡胚尿囊腔内，０．２ｎｉｌ／胚，放　置３７℃温箱培养．弃去２４小时死亡鸡胚，以后每膈　ｉ２小时观察一次，收取死亡鸡胚碌囊液，并观察鸡　胚病变　２。　１．８病毒鉴定　１．８．１病毒血凝性测定：按常规微量血凝试验方　法测定。　１．１Ｏ回归试验将分离病毒经肌肉途径接种于３ｏ　日龄的健康雏鸡，０．２ｍｌ／只毒液，各接种４只，观察试　验鸡发病死亡情况，并从发病死亡鸡中分离病毒。　１．１１疾病防治对比试验我们将分离病毒分别经　鸡胚增殖后，与Ｌａ　Ｓｏｔａ株按一定比例混合，辅以蜂　胶为佐剂制备“复合新城疫蜂胶灭活疫苗”，在强毒　发病疫区与一养鸡户合作。同栋鸡舍中饲养新罗曼　蛋鸡１０ＣＯ只（鸡群日龄２５日龄），分成两组每组５００　只，其中一组胸部肌肉注射“复合新城疫蜂胶灭活疫　苗”０．５ｒｒｄ／只，另一组用常规“新城疫蜂胶灭活疫苗”　免疫，免疫后观察结果。　２结果　１．８．２病毒的形态与大小：分别取分离毒株的ＳＰＦ鸡　胚绒尿液各１滴，用２％磷钨酸负染１分钟后电镜观察。　１．８．３应用新城疫Ｌａ　Ｓｏｔａ株标准阳性血清的Ｈ【　实验：在培养病毒液内等量加入新城疫阳性血清，　按常规微量血凝抑制试验方法测定　Ｊ。　１．８．４血清中和试验：在培养病毒稀释液和　病毒稀释液内按１：２０的量加入新城疫阳性血清，　３７℃作用３Ｏ分钟后接种９一１０日龄健康鸡胚，各ｌＯ　枚，弃去２４小时死亡鸡胚，以后每隔６小时观察１　次，并测死亡鸡胚的尿囊液的血凝性，记录结果。　２．１病毒分离　鸡胚在接种后６ｏ小时内死亡，其　中１和３号毒株在４０小时内死亡，其他在４８—６ｏ小　时死亡，死亡胎儿全身严重出血、水肿，呈现透明状，　肝脏有点状坏死灶和出血斑点。　１．９病毒的生物学特性的测定　ｌ，９．１病毒血凝解脱及血凝素热稳定性试验：将１　号…２　３　４…５　６　７号、Ｆ嘏Ｅ８、Ｌａ　Ｓｏｔａ株按标准方法分　２．２病毒鉴定　２．２．１病毒的血凝性：取死亡鸡胚的尿囊液按１、８．１　中提供的方法进行ＨＡ实验，结果：ＨＡ：２　～　别测定其对鸡红细胞的凝集价（ＨＡ），读数后振荡，　使红细胞悬浮，４屯过夜，读数后再悬浮，再于２小时　后读ＨＡ值。洗脱速度分为“快速”、“中速”和“慢　速”。第１次悬浮过夜后不凝集者为“快速解脱”，第　２次悬浮２小时不凝集者为“中速凝集”，仍凝集者为　２．２．２病毒的形态大小：经电镜观察，均见有大量　相同形态和大小的７个毒株病毒颗粒。病毒颗粒成　大小不一，形态不正，表面有密集的纤突结构，病毒　内部有囊膜包裹着的螺旋对称的核衣壳，病毒颗粒　大小平均直径为１２０ｎｍ左右。　“慢速凝集”。将上述９株病毒以１５００～２（Ｘ￣／ｍｌｎ离　心ｌ０分钟，每株取上清液０．５一ｌｍｌ，装于小试管中，　置５６水浴中１、３、５、ｌＯ、３ｏ、６０分钟．立即冷却后测定　经过处理的ＨＡ值，不凝集者证明血凝索消失＿ｌ－。　１．９．２最小致死量致死鸡胚的平均时间（ＭＤＴ）、１　２．２．３　ＨＩ试验结果：按１．８．３中提供的方法进行　Ｈ【试验，结果：抑制了病毒的血凝活性。　２．２．４血清中和试验结果：按１．８．４提供的方法进　行，中和Ｆ龋Ｅ９株后，该中和物不能致死鸡胚，其他　分离株中和后能够致死鸡胚，但比单独接种该病毒　致死鸡胚的时间长１２小时左右。死亡鸡胚均有血　凝性ＨＡ：２　。　日龄雏鸡脑内致死指数（ＩＣＰＩ）、６周龄雏鸡静脉致死　指数（ⅣＰＩ）的测定：按照《中华人民共和国兽用生　物制品规￣｝（１９９２年版）规定的标准方法执行　。　２．３分离ＮＤｖ毒株的生物学特性测定结果见表１。　表ｔ分离ＮＤＶ毒株的生物学特性测定结果表　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｂｉａｏｇｌｃａｌ　ｐｒｏｗ．ｒ￣ｏｆＮＤＶｉｓｏｌａｔｅｓ　注：ＮＨＡＴ－－病毒耐红细胞凝集解脱时间（快．中、慢）；Ｈ０卜红细胞凝集素的耐热时同（５６℃，ｍｍ）　Ｈ如ｇ：ＮＨＡＴ－－Ｎｏａｈａｅｎ￣，ｇｌｕｆｉｎａｉｌｏｎ　Ｔｉｍｅ（ｋｔ．ｍｏｄｅｒａｔｅ．：ｌｆｏｗ）；ＨＯ卜Ｈ　ｕｕｏｎ　ｈｅａｔ－ｓｍｂｉｌｉ￣　维普资讯 http://www.cqvip.com

中国预防兽医学报　２００２正　２．４回归试验被接种的鸡只，在接种３天后开始　发病，在１０日内全部死亡，采集病死鸡肝脏、脾脏，　按１．２．１提供的方法处理接种鸡胚，培养后测其血　凝性，均有血凝性。用采集脾脏无菌涂布马丁琼脂　平板，３７　，培养４８小时，没有细菌生长。　２．５疾病防治对比试验　当鸡群饲养至４５日龄　时，由于气温突然降低，饲养户所在村的许多鸡群发　生了大面积的呼吸道疾病，甚至出现了大面积的死　亡，继而本群鸡也相继出现了呼吸道症状，用ｋａ　Ｓｏｔａ　系弱毒苗免疫　几乎全群发病，发病率在９５％以上，　发病ｌＯ天后死亡率高达９０％，余下的鸡表现歪头、　斜颈、转圈、耷翅、瘫痪等症状，完全健康的鸡只仅有　几只，但用“复合新城疫蜂胶灭活疫苗”免疫的鸡仅　有约５％　１０％的鸡表现轻微的呼吸道症状，发病　１Ｏ天后仅有２只死亡，其他完全健康。用新城疫蜂　胶灭活疫苗免疫的鸡约有１０％一ｌ５％的鸡表现出　呼吸道症状，发病ｌＯ天后死亡２０多只，死亡率约　５％　３小结和讨论　３．１通过本次实验结果表明，今年在山东省养鸡业　中流行的疫病是由新城疫病毒强毒引起。本课题组　通过大量的临床病例观察发现，在此次疫病过程中，　具有高水平新城症ｍ抗体（１：２　０）的鸡群，没有　受到疾病的侵袭。而Ｈｌ抗体水平达到（１：　。）的　鸡群能够受到疾病侵袭ｌＪｊ　Ｊ，症状表现如：一过性的　呼吸困难、呼噜，幼鸡出现少量死亡，成鸡表现产蛋　量大幅下降，降幅可达４０％～６ｏ％，约１个月后恢复　到原来的９０％，不再上升，并且维持时问明显缩短　ｍ抗体水平达到ｌ：２。以下的鸡群很容易受到疫病　侵袭，并且疫情很难控制．雏鸡死亡率可达９５％以　上，这与范根成的报道【Ｉ１相一致。　３．２通过本次实验结果及流行病学调查表明，今年　我们分离的这几株病毒是在多种日龄的鸡群中分离　获得的，根据本次实验结果及流行病学调查表明，特　别是这几株病毒的血凝性能够被新城疫ｋａ　Ｓｏｔａ株阳　性血清所抑制，但与新城疫Ｌａ　Ｓｏｔａ株阳性血清１：２０　比例进行鸡胚中和试验，病毒却不能被中和，仍能够　致死鸡胚；也可从病毒的生物学特征来看，流行的新　城疫病毒的毒力并不比标准强毒Ｆｌ勰Ｅ９株强，这足　以说明当前流行的新城疫病毒产生了～定的变异，　这可能与近几年大剂量免疫弱毒苗，病毒在受到免　疫压力下Ｆ蛋白产生了变异所致【　，分离的ＮＤＶ强　毒的基因型正在测定中。笔者认为在一个比较小的　区域内（一个鸡场）几种基因型病毒同时流行且基本　表现同一症状的可能性较小，有可能是一种基因型　病毒在不同鸡群免疫状态不同时的表现形式。但就　全国或某一个特定的行政区域而言，则有可能同时　流行几种基因型的病毒，免疫鸡群将同时受到几种　基因型病毒的成胁，这无疑给新城疫的免疫防翩带　来极大的困难　３．３从本次疾病流行的情况来看，我们认为导致鸡　群感染发病的主要原因有以下几种可能，（１）免疫次　数过于频繁抗体抗原之间互相抵消或免疫量过大造　成免疫麻痹。（２）与法氏囊病同时免疫或免疫后５　—７天内免疫新城疫弱毒苗结果造成新城疫免疫抗　体应答效果不理想。（３）饲养环境的污浊，不注重禽　舍的卫生工作，能过则过，思想麻痹大意等等，（４）近　几年大剂量免疫弱毒苗，病毒在受到免疫压力Ｆ蛋　白产生了变异，基因型发生了改变，造成了常规疫苗　免疫效果不够理想Ｌ３，４一。　３．４利用本次分离的病毒作为种毒，通过鸡胚培养　的病毒液当ＨＡ效价达２　以上时，与Ｃｌｏｎｅ．３０　株，按一定比例混合并辅以蜂胶为免疫增强剂以笔　者独创的蜂胶纳米疫苗制造技术制备了“复合型新　城疫蜂胶灭活疫苗”，在全国ｌＯ余个省市进行了　３０００万羽鸡的免疫区域试验，取得了非常理想的免　疫效果。　参考文献　［１ｊ范韫成．来可光．王永玲，等．新城｛莛病毒强毒株的分离与鉴定　『』１．中国兽医学报，１　．１９（２）：１１４—１１７．　［２　Ｂｗ卡尔尼克（高福，刘文军主障）禽病学［Ｍ：．第９版北京：　北京农业大学出版杜．［９９１　［３ｊ曹殿军，苑纯舞、郭金鑫．等新城痤病毒　马株及茅北地区流行　株Ｆ基因遗传变异分析［Ｊ］．中国兽医学报．２Ｏ０Ｏ．如（２）：１１７—１２０　４Ｊ张秀美９９’多发鸡宿流行特点及防制　］．山东家禽，２Ｏ０Ｏ，（１）：ｌ一２．　５］中华人匠　和囤农业部中华＾民共和国兽用生物制品规程，１９９２．　［６１程安春　王铭书．汪开疏，等．现代禽病诊断和防治垒书［Ｍ１成　都：四Ｊ』】大学山版社，１９９７．