基于基因序列的乙型肝炎病毒基因分型方法的比较

第３７卷第２期　南昌大学学报（理科版）　ＶｏＩ．３７　ＮＯ．２　２０１３年４月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ａｐｒ．２０１３　文章编号：１００６—０４６４（２０１３）０２—０１７９－０６　基于基因序列的乙型肝炎病毒基因分型方法的比较　邹淑慧　，应　颖　，周　艳　，熊　英。，余克花　，刘金辉ｈ，莫　冰　（１．南昌大学医学院微生物学教研室，江西南昌　３３０００６；２．江西儿童医院检验科，江西南昌　３３０００６；　３．江西省疾病预防控制中心疾病监测所，江西南昌　３３００２９）　摘要：采用３种不同的生物信息分析法对ＨＢＶ　Ｓ基因序列进行分析以鉴定ＨＢＶ基因型，并比较分析各方法的　优缺点。采集１０例ＨＢＶ慢性感染者血清，抽提ＨＢＶ　ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增ＨＢＶ　Ｓ基因并测序。分别采用Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　软件和Ｂｉｏｅｄｉｔ软件计算ｓ基因核苷酸和氨基酸同源性；ＤＮＡｓｔａｒｔ软件、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ软件和Ｍｅｇａ　４软件绘制ｓ基因　遗传进化树；以及在线Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ软件，将１Ｏ例ｓ基因序列与不同型及亚型ＨＢＶ　Ｓ序列比较以鉴定基因型及亚　型。Ｓ基因核苷酸和氨基酸同源性计算结果显示１，３，４，５，７，８，９，１０号标本与Ｂ２　ＡＦ１２１２４３同源性最高，核苷酸同　源性分别是９８．０　，９９．０　，９８．８　，９９．１　，９９．２　，９９．５　，９９．５　，９９．６　，而２号标本与Ｃ２　Ｍ３８６３６同源性最　高，核苷酸同源性为９７．７　，６号标本与Ｃ４　ＧＱ３７７６３０同源性最高，核苷酸同源性为９７．３　；构建系统树法鉴定结　果为１，３，４，５，７，８，９，１０号标本与Ｂ２　ＡＦ１２１２４３进化距离最近，而２号标本与Ｃ２　Ｍ３８６３６进化距离最近，６号标本　与ｃ４　ＧＱ３７７６３ｏ进化距离最近；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ比对发现１，３，４，５，７，８，９，１０号标本属于Ｂ基因型，２，６号标本属于ｃ　基因型。结论ｓ基因核苷酸及氨基酸同源性的计算法可有效用于乙型肝炎病毒基因分型，是对现有分型方法系统　树构建法以及在线Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ法的补充。　关键词：乙型肝炎病毒；基因型；基因测序　中图分类号：Ｒ５１２．６　文献标志码：Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ＺＯＵ　Ｓｈｕｈｕｉ　，ＹＩＮＧ　ｙｉｎｇ　，ＺＨＯＵ　Ｙａｎ　，ＸＩＯＮＧ　Ｙｉｎｇ。，ＹＵ　Ｋｅｈｕａ　，ＬＩＵ　Ｊｉｎｈｕｉ¨，ＭＯ　Ｂｉｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｃｉａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｎａｎｃｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０ＯＯ６，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｅｈａｎｇ　３３００２９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｈａｔ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｓ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ．Ｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｆｒｏｍ　ＨＢＶ　ＤＮＡ　ｅｘ—　ｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｔｅｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｄｉｔ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｉｎ　ｍｅｔｈｏｄ　１　ｔｏ　ｃａｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｆ　Ｓ　ｇｅｎｅ；ＤＮＡｓｔａｒｔ、Ｃｌｕｓｔ—　ａｌ　Ｘ　ａｎｄ　Ｍｅｇａ　４（ｍｅｔｈｏｄ　２）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　Ｓ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｏｎｌｉｎｅ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ｖｒｉａｌ　ｇｅｎｅ（ｍｅｔｈｏｄ　３）ｗｅｒｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　Ｓ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　１　０　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｉｔｈ　Ｓ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｒｅｆｅｒ—　ｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＨＢＶ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅｉｒ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ．　Ｍｅｔｈｏｄ　ｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓａｍｐｌｅｓ　１，３，４，５，７，８，９，１　０　ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｗｉｔｈ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＡＦ１２１２４３（ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｂ２）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　９８．０％、９９．Ｏ　、９８．８％、９９．１　、９９．２％、９９．５　、　９９．５　９／６　ａｎｄ　９９．６　９／６　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｓａｍｐｌｅ　２　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｗｉｔｈ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｍ３８６３６　（ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｃ２）ｗｉｔｈ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　９７．７　９／６；Ｓａｍｐｌｅ　６　ｗｉｔｈ　ＧＱ３７７６３ｏ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｃ４）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅ—　ｏｔｉｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　９７．３　．Ｍｅｔｈｏｄ　２　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　１，３，４，５，７，８，９，１０　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｓａｍｅ　ｃｌａｄｅ　ｏｆ　ＡＦ１２１２４３（ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｂ２）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔｅｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ，ｗｈｅｒｅ　ｓａｍｐｌｅ　２　ｗａｓ　ｉｎ　ａ　ｃｌａｄｅ　ｏｆ　Ｍ３８６３６（ｇｅｎ一　收稿日期：２０１３—０１—０５。　基金项目：江西教育厅科技基金资助项目（ＧＪＪ１２０６９）。　作者简介：邹淑慧（１９８８一），女，硕士生。＊通信作者：刘金辉（１９６５一），男，教授。　・　１８Ｏ・　南昌大学学报（理科版）　２０１３焦　ｏｔｙｐｅ　Ｃ２）ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅ　６　ｗａｓ　ｉｎ　ａ　ｃｌａｄｅ　ｏｆ　ＧＱ３７７６３０（ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｃ４）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔｅｓｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ．Ｗｉｔｈ　Ｍｅｔｈｏｄ　３，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　１，３，４，５，７，８，９，１０　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔＯ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｂ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　２，６　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　Ｃ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｃｏｎ—　ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｎｌｉｎｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ，ａｓ　ａ　ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ；ｇｅｎｏｔｙｐｅ；ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　乙型肝炎病毒（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）可在　世界范围内引起急慢性乙型肝炎，并导致肝硬化、肝　ａｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ＨｉＦｉ）试剂盒及ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ购　自北京Ｔｒａｎｓｇｅｎ生物科技有限公司；ＰＣＲ产物交　功能衰竭甚至肝癌＿】］。ＨＢＶ基因组长月３．２　ｋｂ，　由四个开放读码框组成，分别是Ｐ，Ｃ，Ｓ和Ｘ基因。　其中Ｓ基因编码的前Ｓ１，前Ｓ２和Ｓ蛋白，构成　ＨＢＶ的包膜刺突蛋白，其包含识别靶细胞受体的结　构域和诱导中和抗体反应的“ａ”抗原决定簇。根据　基因组序列核苷酸异源性≥８　或Ｓ基因序列核苷　酸异源性≥４　，ＨＢＶ分为Ａ—Ｊ十种不同的基因　型　］。ＨＢＶ基因型对感染的临床表现、预后及药物　疗效有重要的影响。因此鉴定ＨＢＶ基因型对于预　测预后，制定治疗方案有指导意义＿３］。国内外许多　学者采用多种研究方法来鉴定ＨＢＶ基因型，这些　方法包括基因序列测定、ＰＣＲ—ＲＦＬＰ法、ＨＢＶ基因　型特异性引物ＰＣＲ、ＨＢＶ基因型特异性线型探针　检测法、实时荧光ＰＣＲ等　］，其中依据基因序列是　ＨＢＶ基因分型的金标准。　本研究采用３种不同的生物信息分析法，基因　核苷酸及氨基酸同源性的计算法，系统树的构建法　以及在线Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ比对法对Ｓ基因序列进行分　析以鉴定ＨＢＶ基因型，比较分析３种方法的优缺　点，为ＨＢＶ基因定型提供更多可靠的方法和依据。　１材料和方法　１．１　材料　１．１．１病例来源研究对象：收集ＨＢＶ感染血清　标本１Ｏ份。诊断标准为：慢性乙型肝炎患者均符合　２０００年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病　学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案ｌ＿５］。　１．１．２　试剂　乙肝病毒６项（包括ＨＢｓＡｇ，ＨＢ—　ｓＡｂ，ＨＢｅＡｇ，ＨＢｅＡｂ，ＨＢｃＡｂ，ＰｒｅＳ）诊断试剂盒由　中山生物工程有限公司提供；ＤＮＡ提取液购自中山　大学达安基因股份有限公司；ＨＢＶ　Ｓ基因扩增引　物，正向引物Ｆ４　５，＿ＣＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＧＣＣＴＣＡＴ一３　ｎｔ２７９３—２８１０和反向引物Ｒ４　５，－ＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴ—　ＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣ一３　ｎｔ８３７～８１８，由上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　生物科技有限公司合成；ＴｒａｎｓＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒ—　上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物科技有限公司测序。　１．１．３　ＨＢＶ基因序列的来源从ＧｅｎＢａｎｋ获得　不同基因型ＨＢＶ　Ｓ基因序列，分别为：Ａ—　ＨＥ５７６９８９一Ｆｒａｎｃｅ，Ｂ－ＡＢ６７５６７６一Ｃｈｉｎａ，Ｃ—　ＧＱ３７７６０１一Ｃｈｉｎａ，Ｄ—ＡＢＯ９０２６８一Ｊａｐａｎ，Ｅ—　ＨＭ３６３５６５一Ｎｉｇｅｒｉａ，Ｆ—ＤＱ７７６２４７一Ａｒｇｅｎｔｉｎａ，Ｇ－　ＧＵ５６５２１７一Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。Ｈ—ＨＭ１１７８５１一Ｍｅｘｉｃｏ．Ｉ—　ＡＦ２４１４０９一Ｖｉｅｔｎａｍ，Ｊ—ＡＢ４８６０１２－ｊａｐａｎ；ＨＢＶ　Ｂ，Ｃ　各亚型Ｓ基因序列分别为：Ｂ１一ＡＢ１０６８８４一Ｊａｐａｎ，　Ｂ１一Ｄ２３６７８一Ｊａｐａｎ，Ｂ２一ＡＦ１２１２４３一Ｓｗｅｄｅｎ，Ｂ２一　ＡＹ２１７３５５一Ｃｈｉｎａ，Ｂ３一ＡＢ０３３５５４一Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，Ｂ３一　Ｍ５４９２３一Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，Ｂ４一ＡＢ１１５５５１一Ｖｉｅｔｎａｍ，Ｂ４一　ＡＢＯ７３８３５一Ｖｉｅｔｎａｍ，Ｂ５一ＡＢ２１９４２９一Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ，Ｂ５一　ＡＢ２４１１１７一Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ，Ｂ６一ＡＢ２８７３１４一ＵＳＡ，Ｂ６一　ＤＱ４６３７９２一Ｃａｎａｄａ，Ｂ７一ＥＦ４７３９７６一Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，Ｂ７一　ＥＦ４７３９７７－Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，Ｃ１＿ＡＢ１１１９４６一Ｖｉｅｔｎａｍ，Ｃ１一　ＡＦ１８２８０２一Ｃｈｉｎａ．Ｃ２一ＡＦ２２３９５４一Ｓｗｅｄｅｎ．Ｃ２一　Ｍ３８６３６一Ｋｏｒｅａ，Ｃ３一Ｘ７５６５６一Ｐｏｌｙｎｅｓｉａ。Ｃ３一Ｘ７５６６５一　ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ，Ｃ４一ＡＢ０４８７０４一Ａｂｏｒｉｇｉｎｅｓ，Ｃ４一　ＧＱ３７７６３０一Ｃｈｉｎａ，Ｃ５一ＥＵ４１００８０一Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ，Ｃ５一　ＧＱ９２４６２０一Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｃ６一ＧＱ３５８１５６一Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ。　１．１．４基因分型软件　在线软件Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（ｈｔ—　ｔｐ：／／ｗｗｗ．　ｎｃｂｉ．　ｎｌｍ．　ｎｉｈ．　ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｔｙ—　ｐｉｎｇ）。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｘ软件欧洲生物信息研究所（Ｅｕｒｏ—　ｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）开　发。Ｂｉｏｅｄｉｔ软件是由美国宝蓝软件公司（Ｂｏｒｌａｎｄ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）开发。ＤＮＡｓｔａｒｔ软件由美　国威斯康星大学研发。Ｍｅｇａ　４软件由美国亚利桑　那州立大学研发　］。　１．２　方法　１．２．１　乙肝６项的测定　参照各个诊断试剂盒的　的方法对乙肝６项进行测定。　１．２．２　病毒ＤＮＡ提取　１．５　ｍＬ　Ｅｐ管加入患者　血清或阴性对照品５Ｏ　Ｌ，再加入５０　Ｌ　ＤＮＡ提取　液，振荡混匀５　Ｓ，１００。Ｃ恒温１０　ｍｉｎ，１２　０００　ｒ・