低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白

一、 实验目的

利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白（Ig），并获得副产物血清白蛋白。

二、 实验原理

（1）低温乙醇法Cohn6法：美国哈佛大学Ｅ·Ｊ·COHN教授研究组，在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。

方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排斥水分子，使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚。不过由于有机溶剂存在，降低了蛋白分子表面憎水基团的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。（文献20）

分离过程中，二法通过五个因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白质分子“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电点时易于沉淀；②电解质浓度：在低离子浓度下，对蛋白质溶解度有较大影响；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时，蛋白质溶解为吸热反应，溶解度随温度上升而增高。

经实验得知，利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。 (2) Cohn氏9法；该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图: 第1 / 8页

乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。其体积可按下式计算：

式中V＝所需乙醇体积；V0＝原来溶液体积；C 1＝原来溶液乙醇浓度；C2＝所需达到乙醇浓度；C3＝加入乙醇的浓度。

三、 材料和试剂 3.1 血清：100 mL

3.2 相关试剂：95%乙醇，pH 4. 0醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液Ⅰ，磷酸盐缓冲液Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO3 ，生理氯化钠溶液，麦芽糖， 3.3 实验仪器：

四、 方法与步骤 基本思路：

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血清的初处理——利用Cohn6法得到组分Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn9法得到IgG——IgG沉淀的保存（浓缩蛋白液或冻干品）——Ig物理性状及生化检定（蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性） 4.1 血清的初处理（文献[4]，名词.txt中关于血清的部分） （1）将血清从冷冻箱（-5C至-20℃）取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解

（2）在室温下使之全溶。以上操作注意随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

（3）热灭活（目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，通常因为高温处理影响了血清的质量，故省略）。

4.2 低温乙醇法提取Ig及副产物Alb（生物制品基础摘录4~5，文献4、17） （1）量取血清体积100 mL，搅拌降温至0~4℃，将血清调pH 7.2，调节NaCl浓度至0.14 mol/L，加乙醇至8%，加入乙醇的时间控制在60~90 min；从加乙醇开始起为反应体系降温，保持反应温度在-2~-4℃；加完乙醇后取样测pH值，调节pH值为7.2；继续搅拌1 h，静置30 min；3000 r/min离心10 min，去除上清，收集沉淀并称取质量。 （2）沉淀中加入0~4℃的注射用水，加水量为沉淀质量的7倍，持续搅拌直至成为均匀的蛋白浆；取样测pH值，蛋白浆中加磷酸盐缓冲液Ⅰ在-5℃，调pH 6.9~7.1，加0.05 mol/LNaCl，加乙醇至25%，从加乙醇开始起为反应体系降温，保持反应温度在-5℃；加完乙醇后取样测pH值，调节pH值为6.9~7.1；继续搅拌1 h，静置30 min；3000 r/min离心10 min，去除上清，收集沉淀并称取质量，沉淀即为免疫球蛋白。

（3） 将上述操作所得清夜在-5℃，调节pH至4.8，加乙醇至40%，加后反应30 min，搅拌1 h，进行离心，离心速度小于8000 r/min，取沉淀干燥，即为粗提取的副产物Alb。 4.3 Ig沉淀的保存

（1）蛋白液的浓缩方法

用0~4℃生理氯化钠溶液溶解沉淀，加量为沉淀质量的10倍，搅拌至完全溶解；取样测pH值，蛋白溶液中加入1 mol/L HCl，调节pH值为3. 60~4. 40。 将聚乙二醇(PEG， 即car—bowax4000W )用pH 值7.2~7.4、0.01 mol／L的PBS配成30％溶液，将装有蛋白液的透析袋浸入，在冰箱内浓缩5~12 h，一

般可浓缩至原体积的1/3～1/20。用过的PEG在蒸发除去水分后可以重复利用。 （2）冷冻真空干燥

4.4 Ig物理性状及生化检定（文献22）

（1）蛋白含量的测定：紫外吸收法（生物制品基础摘录8，文献25）

将PEG 浓缩后的待测蛋白质溶液稀释10倍，使其光密度在0．2-2．0之间， 在波长280 nm 和260 nm处以0．0175 mol/L、pH 值6.7的磷酸缓冲溶液作空白对照， 分别测得待测样品的光密度值(OD280 和OD260)。应用280 nm 和260 nm 的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。计算公式为 蛋白质浓度=(1．45 OD280-0.74 OD260)x稀释倍数

（2）Ig纯度分析：SDS-PAGE电泳（生物制品基础摘录9~11，文献25） 在厚度为1 mm 的垂直电泳板上进行不连续电泳，样品的加样量为5μL。电泳过程中，浓缩胶部分保持电流15 mA，进入分离胶后，电流为25 mA 。电泳结束后，将胶片用含有33％ 甲醇和12％三氯乙酸的固定液固定4 h，然后用考马斯亮蓝(CBB)G-250染色液(含有1.05 mmol/L的CBBG-250，1.0 mol/L 硫酸，10 mol/L 的NaOH ，12%的TcA)染色3 h。染色结束后，

用蒸馏水对胶片进行洗脱，直至底色基本脱去为止。采用表1所示标准蛋白质：

（3）Ig各组分含量测定：SephadexG-200凝胶柱层析法（文献22）

（4）Ig免疫活性的测定：？ （5）Ig的稳定性检验： IgG制品置57±0.5℃水浴保温4 h后,无凝胶化和絮状物（文献22） （6）Ig固体总量测定：用以计算纯度或某一成分的单位含量。干烤恒重法（生物制品基础摘录14） （7）多聚体含量测定：用HPLC法

需要注意的几个地方：

在低温乙醇法白蛋白生产中，影响收率的几个重要因素：A、必须缓慢加入；

B、边加边搅拌；C、避免产生泡沫。使蛋白的溶解度呈一个光滑的曲线

（1）乙醇是蛋白沉淀剂，也是蛋白变性剂，故沉淀反应在低温进行。单纯从防止变性出发，温度越低越好，但不能低于冰点，还要兼顾各种蛋白在不同温度的溶解性不同，温度过低也影响分离结果，必须通过系统试验，优选出最适的工艺参数。 （2）往水溶液中加乙醇时是放热反应，必须有高效的制冷系统，但不能使温度升高，还要使其降低。随着乙醇浓度的增高，温度变化并非一条直线，当浓度在0-20％范围内逐渐增加时，温度急剧上升，当浓度超过20％，再增加时，温度几乎不再变化。

故在加乙醇时从0－20％－30％，特别是0％-10％的阶段必须缓慢，超过30％时即可加速。

（3）除乙醇的浓度外，pH及u极为重要，一般情况下，pH•越接近iep，u越低，蛋白越容易沉淀。精确调整pH及u•的值，可在较低的乙醇浓度下，达到分离蛋白的目的。PH测定使用玻璃电极，应在标准条件下22℃~25℃测得数值。用生理盐水稀释至乙醇浓度不再影响pH值。

（4）蛋白浓度太高，由于其沉淀现象，使分离发生困难，太低则沉淀聚集时间长，而且加大容器体积，一般以2.5％~3.0％为宜。

（5）沉淀的分离与再溶解，造成一种条件，使一种蛋白溶解，也使另一种蛋白沉淀，即使两者溶解度相差100-1000倍。一般条件下，离心或沉淀呈糊状，固体湿重最多达25％－30％，其余为母液，欲提高纯度和收率，须用少量洗涤液洗涤沉淀，或将沉淀溶解再反复沉淀。沉淀加适量的溶解液应易于溶解，溶解后如再有少量不溶物，可再加一些溶解液如仍不溶解，不溶物多为变性蛋白，应过滤除去。

五、 实验记录

六、 实验中可能出现的问题以及解决方案 6.1 等电点共沉淀，影响纯度

6.2 产生多聚体或聚合物，失去免疫活性（文献19）

附图二：实验室冻干制品的制备

实验室制备冻干品的简单装置如图(a)，样品干燥时，先在培养皿内铺成薄层（厚度不超过1cm的液体），置于低温冰箱内冻固。另在真空干燥器内用二个培养皿分别旋转固体氢氧化钠和五氧化二磷，真空干燥器上端抽气管通过五氧化二磷干燥管与真空泵相连。当放进待干燥的冻块后，立即封闭干燥器，开动真空泵，经5~10小时后得冷冻干燥品。另一实验室简易装置如图(b)，将待干燥物质置于圆底容器中，然后浸入干冰（固体）乙醇混合而成的冷却剂中，容器内液体迅速冻成固体，抽真空后待干燥冻块的水分子升华变成气体，经过冷凝器凝结为霜。冰冻的样品逐渐失去水分变为疏松干燥的粉末。上述操作关键在于真空泵的真空度及管道的口径。（生物制品基础摘录16~17，《实用蛋白质制备技术》，P217~218，文献4）