链霉菌育种方法与作用机制研究综述

链霉菌育种方法与作用机制研究综述

作者：李玉彬 钱晓璐

来源：《现代农业科技》2010年第15期

摘要链霉菌是放线菌中非常重要的一个属,具有广泛的物种多样性和代谢多样性,它能产生多种抗生素和其他活性物质,在临床和农业上具有广泛的应用。但是,由于链霉菌普遍存在的遗传不稳定性,大大限制了其功能的发挥。因而,除了通过新的技术手段筛选新的活性菌株,研究人员多采用对现有链霉菌的改造育种来实现抗生素产量的提高和稳定,或者生产新的抗生素。主要论述了链霉菌育种中常用的4种方法,即物理诱变、化学诱变、生物工程改造和复合诱变。同时,引证近年来链霉菌育种实例,对这些育种方法的作用机制进行了简要的阐述和总结。 关键词链霉菌;育种方法;作用机制

中图分类号 Q939.9 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)15-0019-03

自从1943年Waksman首先从链霉菌中发现链霉素来,放线菌就成为抗生素、酶及其抑制剂等活性物质的重要产生菌[1]。目前已经被分离和描述的放线菌至少有180个属,4 000多种[2]。采用传统的方法,分离新的放线菌和新的活性物质,已经变得非常困难[3]。对已知的抗生素产生菌进行改造和育种,从而使其产生新的抗生素或使原有抗生素的产量和质量得以提升[4]已经成为各国学者研究的新热点和方向。就链霉菌的育种方法进行了系统的整理,结合近几年的育种实例,对育种方法及其作用机制进行了简要的阐述和总结。

1物理因素诱变育种

物理因素诱变的方法主要包括紫外线诱变、激光辐照诱变、微波诱变、离子注入诱变和空间作用诱变等。其中,激光辐照诱变又分为He-Ne激光诱变、铜蒸汽激光诱变和快中子辐照诱变3种。

1.1紫外线诱变

紫外线是一种使用时间长、效果好,诱发设备简单的诱变剂。绝大多数的高产抗生素产生菌都使用过紫外线诱变进行育种[5]。通常将放线菌制成孢子悬液,用30 W波长稳定的紫外灯在30 cm处进行照射,期间用磁力搅拌器对悬液进行搅拌,使其接受均匀。处理完成后,为防止回复突变,应暗处涂布并于黑暗培养。黄世文等[6]对淡紫色吸水链霉菌进行紫外线诱变后,获得的菌

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株发酵液对受试菌水稻纹枯病抑菌效果较诱变前有明显提高,同时证实了处在生长分裂初始阶段的链霉菌对紫外线作用较敏感,易发生变异。黄永春等[7]以吸水链霉菌海南变种为出发菌,经连续2次紫外诱变后选育出对小麦赤霉菌有很好抑菌效果的高产菌株,菌株产抗生素能力比初始菌株提高了30.06%,且在斜面连续传代5次后仍有稳定的遗传性状。李继安等[8]将经紫外线诱变处理的博来霉素产生菌孢子涂布在含链霉素的培养基平板上,筛选出可抗性突变菌株,产量阳性效率达到了12.6%。 1.2激光辐照诱变

使用一定量的激光照射菌体,激光的能量被菌体内部的生物大分子吸收,引起分子激发光解离以及自由基反应,而引起菌体生物性状发生改变,为优良菌种的选育提供了大量的原材料。激光辐照诱变依据其所用的激光类型不同,主要分为He-Ne激光诱变、铜蒸汽激光诱变和快中子辐照诱变3种。

He-Ne激光对生物的诱变机制在于红激光能提高染色体结构的机能状态,增加有效分裂活性,使细胞处于易变状态,通过多光子的吸收而聚积能量,并进行再分配而引起DNA分子的损伤和突变。吴振倡[9]用He-Ne激光辐照龟裂链霉菌高产株单孢子悬液20 min,曾获得高产菌株5221,其发酵单位比未辐照菌株提高了5%。此外,吴振倡[10]还首次报道了应用铜蒸气激光辐照龟裂链霉菌获得高产辐照株,其产量平均提高了10%以上。发酵单位达到国际先进水平。吴振倡等[11]报导铜蒸气激光辐照金霉素链霉菌30 min得到激光高产株,其发酵单位比对照提高12.5%。快中子是一种理想的诱变剂,刘路[12]利用快中子诱变洁霉素产生菌林肯链霉菌,使其摇瓶效价提高了17%。 1.3微波诱变

微波是一种电磁波,使用微波进行链霉菌的诱变操作简单,安全可靠。微波能够刺激菌体细胞内水分、蛋白质、核苷酸、碳水化合物等极性分子的快速运动,这种快速运动所引起的摩擦可以使细胞内DNA之间的氢键和碱基堆积力破坏,DNA结构发生改变,从而引起遗传上的变异。涂璇等[13]通过微波作用对链霉菌702菌株孢子进行不同时间诱变处理,以庆大霉素为致死突变标志,获得了高产抗真菌活性物质的菌株,其摇瓶发酵单位提高了49.9%。郭峰等[14]以微波对南昌链霉菌进行了微波育种,获得了梅岭霉素杀菌剂生产能力高于出发菌株73%的新菌株,多次传代后遗传性状保持稳定。陈力力等[15]利用微波诱变方法对井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种进行诱变处理,挑取单个菌落摇瓶初筛、复筛、测定化学效价,获得的4株突变株比出发菌株分别提高了17.5%、15%、20%、21.7%。连续传代4次,代间化学效价差异不明显,遗传性能稳定。由此可见,微波诱变所导致的产量变化差异较大,但遗传性能稳定性较高,因而可以通过扩大诱变原始菌株数量,增加诱变次数等方式增加获得理想突变株的几率。 1.4离子注入诱变

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离子注入是将低能的离子注入生物体内,通过复杂的能量传递、质量沉积和电荷交换,使染色体发生畸变[16],使裸露的单链和双链质粒DNA发生断裂[17],碱基发生突变[18]等。离子注入不仅可以直接引起碱基分子结构的改变,还可以参与细胞的重组和修复。具有突变率高、突变谱广的优点,容易获得酶活力高的突变株。刘晓秋等[19]用低能N+离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,检测到碱基发生转换、颠换和缺失,其中胞嘧啶发生突变频率最高。向砥等[20]利用离子注入诱变选育高产的壮观链霉菌,获得的高产菌株效价较对照提高了102.3%,可见离子注入诱变较容易获得活力高的突变菌株。 1.5空间作用诱变

空间作用诱变育种是利用空间技术设备(生物卫星、航天飞机等空间飞行器)搭载微生物材料,通过外层空间特殊的物理环境的作用,如微重力、强辐射、低真空等,从而使菌种的DNA分子结构发生变异和重组,得到新的菌种。王璋、刘新征等[21]将链霉菌WZFF.L-M1搭载“神舟”四号飞船进行空间育种,结果筛选出5株遗传性能稳定的菌株,产酶能力提高了30%以上。尽管空间作用诱变对于链霉菌的选育具有良好的效果,但是由于搭载工具造价高昂、程序复杂等因素制约,空间诱变并非主流的诱变方法。除此之外,还有60Co λ射线育种、离子束诱变育种、通电处理诱变育种等物理方法。这些诱变方法也取得了一定的诱变成果。

2化学因素诱变育种

化学因素诱变育种主要是指利用一系列的化学物质,如亚硝基胍、盐酸羟胺、亚硝酸、抗生素、氯化锂、吖啶橙等物质,对链霉菌进行处理,导致基因组中碱基对发生转换、缺失和异位等,如氯化锂可导致AT-GC碱基对发生转换或碱基缺失,从而导致代谢途径等发生改变,产生高产的优良菌株。当前在链霉菌诱变育种上应用的主要是甲基磺酸乙酯、亚硝基胍和氯化锂。涂璇等[22]利用亚硝基胍诱变链霉菌702菌株,获得的高产突变株20-29-12,产素单位比出发菌株提高了38.08%。朱非等[23]以林肯链霉菌947-8为出发菌株,采用孢子热处理方法处理出发菌株孢子,后进行NTG诱变处理,得到的突变株,产林肯霉素为1 218 γ/mL,产量稳定。黄晶等[24]利用硫酸二乙酯对金霉素链霉菌进行诱变,菌株的正突变率达到52%。由此可见,化学诱变的效率也是非常高的,对于链霉菌抗生素产量的提高有非常重要的作用。

3生物工程改造育种

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生物工程改造育种是随着生物技术的发展,尤其是细胞生物学、分子生物学、基因扣作等学科的发展而兴起的育种方式。本文主要从原生质体融合和基因工程育种2个方面对生物工程改造育种进行阐述。 3.1原生质体融合

微生物原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点。通常使用机械法或酶法去除细胞壁制备原生质体,之后在合适的条件下进行人为的诱导融合,采用营养缺陷型、抗药性、灭活标记或荧光染色标记进行融合子的筛选。应用原生质体融合技术可以有效地提高代谢产物的产量和质量;改良菌种的遗传特性,获得新的代谢途径和性状[25]。

原生质体融合中的关键环节在于原生质体的再生,刘金艳等[26]研究了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成和再生条件,通过培养基选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等条件选择和优化,成功获得了原生质体,为转化、基因表达奠定了基础。王记侠等[27]运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,筛选出的融合子对灰葡萄孢的抑制作用提高了27.99%。陈芝等[28]对2株阿维链霉菌(阿维菌素高产株76-05和仅产阿维菌素B不产寡霉素的基因工程菌73-12)进行了原生质体融合,选育出仅产阿维菌素B不产寡霉素的高产菌株。原生质体去除了细胞外壁,仅保留脆弱的细胞膜,因而对各种诱变因素的敏感性强,正突变率高,但是需要解决原生质体再生的条件优化。 3.2基因工程育种

由于产抗生素的链霉菌遗传结构包括抗生素生物合成、抗生素抗性、氨基酸生物合成、色素生成和发育变化等方面的不稳定,大大制约了链霉菌的工业化生产。许多科研工作者将基因工程技术运用到了链霉菌育种之中,这包括:利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控,进而进行抗生素的修饰、改造;采用各种基因操作技术,使不同化合物、不同来源的基因在同一菌株中重新组合,增加代谢产物的多样性[3];利用基因筛选程序,筛选含有特定类型化合物的基因产生菌,进而获得了相应的次生代谢产物[29];利用基因组重排技术对出发菌株进行处理[30]等。

基因组重排是以整个基因组为操作对象的一种DNA重排。其本质就是进行多次的原生质体的融合和再生。美国的Zhang首次提出了这一概念,并应用此技术提高了费氏链霉菌合成泰乐星的能力[30]。徐波等[31]人应用基因组重排育种方法筛选替考拉宁高产菌,其替考拉宁的产量从原始菌株的1 825 μ/mL提高到了3 016 μ/mL,增长了65.3%。徐波等[32]将普那霉素产生菌始旋链霉菌的孢子和原生质体经紫外诱变后的高产突变株进行了4轮基因组重排育种,筛选出的重排菌株普那霉素产量为832 mg/mL,比原始出发菌株提高了206%。

通过基因组测序分析,已经发现在链霉菌基因组中大多数情况是生物合成基因以相近的簇形式存在[33],单拷贝可扩增因子通过速率限制不对称交换以转换成重复结构。组建重组子的可

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扩增因子和重要基因的拷贝数,也可能提高基因产物的表达量[34]。ccaR蛋白对棒状链霉菌中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码,白小佳等[35]通过增加ccaR基因剂量提高了棒状链霉菌克拉维酸的产量,突变株的产酸量是出发菌株的1.54倍。

将生物合成基因与相应的质粒载体重组,导入特定的基因工程菌,由于质粒的高拷贝,诱导表达获得高产量的抗生素。高慧英等[36]对吸水链霉菌17997建立了噬菌体基因转移系统,利用基因阻断技术筛选出了与格尔德霉素生物合成相关基因的柯斯质粒,从而为格尔德霉素的生物合成基因簇的克隆奠定了基础。张红莲等[37]从橄榄绿链霉菌A1中克隆出了木聚糖酶基因xynA,将其与大肠杆菌表达载体pET-22b(+)构建重组子,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到表达,摇瓶培养的表达量达到200 mg/L。随着生物技术的不断发展与进步,尤其是DNA体外重组技术、各种基因工程表达宿主和表达载体的构建和完善,对于链霉菌功能基因的研究越来越深入,功能基因的合成,基因工程菌的改造正逐渐在育种领域发挥出巨大的作用与潜力,逐渐成为链霉菌育种的主流方式。

4复合诱变育种

复合诱变育种是指采用2种或者2种以上的方式进行诱变育种。通过不同的方式作用于微生物菌株的协同效应,可以改变菌株的突变率,从而提高获得理想菌种的几率。通常采用物理方式、化学方式和生物工程育种两两结合或三者同时运用。

余明洁等[38]以白色链霉菌SA为出发菌株,采用紫外照射复合氯化锂诱变选育及亚硝酸诱变选育,得到1株具有遗传标记AEC的抗性突变高产菌株,摇瓶发酵培养ξ-聚赖氨酸产量高达1.64 g/L,较出发菌株提高了57.7%。张建勇等[39]筛选出1株产抗肿瘤活性新抗生素AGPM的藤黄灰链霉菌,经过紫外单因子诱变,紫外线加氯化锂复合诱变等2种诱变方式处理后,AGPM的产量达到18.7 μg/mL,较出发菌株提高了1.2倍。研究还发现,孢子经氯化锂浸泡后,对紫外线的敏感性明显增加,可能是因为氯化锂本身并没有诱变作用,但是复合育种过程中与其他诱变因子具有协同作用,从而导致突变率的增加。

由于不同方式的诱变对链霉菌的DNA作用位点和作用方式的差异,反复使用同种类型的诱变方法可能会出现钝化现象,从而导致链霉菌的回复突变,影响育种效果。因而在链霉菌育种过程中,要尽可能地采用新的育种方式或多种不同的育种方式进行,以提高成功的可能性。 5结语

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物理因素诱变育种、化学诱变育种、生物工程育种,反映出链霉菌育种方法随着科学进步而不断发展的历史。物理和化学诱变育种,虽然有一定的弊端,比如说样本量巨大、筛选过程繁琐等,但是同样具有简单、易行、安全、遗传稳定的优点,仍然是链霉菌育种中不可或缺的育种方法。如采用物理化学因子对原始菌株进行诱变处理后筛选耐药性突变株,通过摇瓶发酵复筛可以选择高产菌株,从而达到淘汰野生型菌株、富集突变型菌株的目的,大大减轻了初筛的工作量,有效地提高了工作效率。生物工程育种则代表这链霉菌育种的发展方向,随着生物学的发展,遗传重组育种、基因表达调控育种、基因工程育种应运而生,并逐渐成为链霉菌育种工程的主流方法。

复合诱变育种,则更多的体现了将各种育种方法进行有机的结合,从而实现有效的互补,最大限度的发挥育种的优势。生物工程育种中,抗性基因、生物合成基因、功能基因的克隆和改造能够直接大幅度的提高抗生素的产量,结合物理和化学诱变方法,获得遗传稳定的高产菌株,对链霉素工业化生产起着举足轻重的作用。

在现有阶段,充分发展生物工程育种,发挥复合诱变育种的组合优势,同时不断开发新的育种方法,已经成为链霉菌育种的发展趋势。随着相关学科的不断发展与进步,链霉菌育种方法将会越来越完善。

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