QX100 Droplet Digital

目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,

NSCLC）临床治疗的重要手段。易瑞沙（Iressa/吉非替尼/Gefitinib,阿斯利康）和特罗凯（Tarceva/厄罗替尼 /Erlotinib,罗氏制药）作为表皮生长因子受体

（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI），是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床治疗表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数EGFR基因突变的病人疗效显著。

大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区（tyrosine kinase coding domain,18～21外显子），其中19外显子多为框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45％；21外显子多为替代突变（主要是L858R），约占所有突变的40％。目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。因此，检测EGFR基因突变对于NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值，而且80％的肺癌患者属于非小细胞肺癌。

对NSCLC患者肿瘤组织的EGFR突变进行检测属于典型的个性化医疗，然而临床上有时很难取得病理组织，于是转而对病人的血浆进行EGFR检测。但采用传统的测序方法，灵敏度往往不够，一般需要突变序列在体液中的比例至少达到30％才能实现检出1；而且血浆中的核酸分子来源于凋亡细胞，往往以片段化的方式存在。

台湾大学基因组医学中心的研究人员采用二代测序（NGS, Ion Torrent）分别对NSCLC患者的血浆以及Buffy Coat中的白细胞进行了EGFR exon 21 L858R位点突变的检测，发现在NSCLC患者的血浆中L858R的比例明显高于Buffy Coat中的白细胞比例，源自Buffy Coat中的白细胞几乎没有L858R的突变。同时该实验室采用QX100对NGS的结果进行了验证，QX100得到的EGFR突变比例（血浆与Buffy Coat来源的白细胞）与NGS结果一致，显示出相同的pattern，进一步验证了NGS的结论。具体结果请见Table I和Table II。

结论：NGS技术以其高通量，大数据产出等优势开启了基因组及后基因组研究的崭新局面，尤其是在单基因疾病及以肿瘤为代表的复杂疾病中发挥了巨大作用。但是对于NGS测序平台而言，由于测序试剂、测序芯片质量波动，DNA序列碱基组成差异及异化，GC含量，重复序列，polyN序列以及参考基因组序列

的错误导致其测序结果存在一定的固有错误率，通常在0.06%-2%。通过实验以及数据分析优化等手段，在实际检测数据中，NGS技术进行稀有突变检测的检出下限在0.1%2,3,4。对于上述采用NGS检出的低丰度突变序列，QX100可以作为有效的确认平台。同时，在更低丰度的稀有突变检测实验中（0.001%-0.1%），QX100技术能够作为NGS漏检的有力补充。

Table I. EGFR L858R Mutation Rates in Blood Plasma of Lung Cancer Patients

1 2 3 4 5 6 7 8 9

FAM (copies/ul)

L858R_T 8.98 9.28 9.49 10.2 14.4 13.8 9.39 15.9 21.2

HEX(copies/ul) L858R_G 1.18 0.956 0.636 0.642 0.862 0.56 0.236 0.33 0.237

Mutation Rate ddPCR 11.6% 9.3% 6.3% 5.9% 5.6% 3.9% 2.5% 2.0% 1.1%

Ion Torrent 4.45% 4.56% 5.08% 2.94% 4.22% 4.77% 5.94% 4.17% 2.11%

Table II. EGFR L858R Mutation Rates in Blood Buffy Coat of Lung Cancer Patients

1 2 3 4 5 6 7 8

FAM (copies/ul)

L858R_T 532 132 148 152 126 126 109 112

HEX(copies/ul) L858R_G 0 0.0686 0.0778 0.0748 0 0.0745 0 0

Mutation Rate ddPCR 0.0% 0.1% 0.1% 0.0% 0.0% 0.1% 0.0% 0.0%

Ion Torrent 0.28% 0.16% 0.07% 0.23% 0.04% 0.16% 0.14% 0.20%

注：FAM标记的探针检测野生EGFR(CACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCT)

HEX标记的探针检测突变EGFR(CACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCT)

Reference

1. Tony K.F. Yung, K.C. Allen Chan, Tony S.K. Mok, et al. Single-Molecule Detection of Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Plasma by Microfluidics Digital PCR in Non-Small Cell Lung Cancer Patients. Clin Cancer Res 2009;15:2076-2084.

2. Michael W. Schmitt, Scott R. Kennedy, Jesse J. Salk, Edward J. Fox, Joseph B. Hiatt, and Lawrence A. Loeb. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencingPNAS, 2012; vol 19: 14508–14513.

3. Patrick Flaherty, Georges Natsoulis, Omkar Muralidharan et al. Ultrasensitive detection of rare mutations using next-generation targeted resequencing. Nucleic Acids Research. 2012, Vol. 40.

4. Mingkun Li and Mark Stoneking. A new approach for detecting low-level mutations in next-generation sequence data. Genome Biology. 2012, 13:R34.