微生物限度检验操作规程

* * * * * * 有 限 公 司 质 量 管 理 标 准 文 件

文件名称 编 制 人 审 核 人 版 本 号 颁发部门 1.目的

规范菌落总数检验操作，确保检验数据真实有效。 2.适用范围

适用于本公司菌落总数检验操作规程。 4.依据

检验规程参照《GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。 4. 内容

4.1 菌落总数定义：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度、和培养时间等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。

4.2 仪器与材料：除微生物实验室常用的灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下 4.2.1 恒温培养箱：36℃±1℃ 4.2.2 冰箱：2℃-5℃， 4.2.3 恒温水浴锅：46℃±1℃， 4.2.4 天平：感量为0.1g， 4.2.5 均质器

4.2.6 无菌吸管：1ml（具有0.01ml刻度）、10ml（具有0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。

4.2.7 无菌锥形瓶:容量瓶250ml、500ml 4.2.8 无菌培养皿：直径90mm 4.2.9 pH计或pH比色管或精密pH试纸 4.2.10 放大镜或菌落计数器

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4.3 培养基和试剂 4.3.1 平板计数琼脂培养基 4.3.2 虎红培养基

4.3.3 硫乙醇酸盐流体培养基 4.4 操作步骤： 4.4.1 样品稀释： 4.4.1.1

（1）半固体、固体样液制作：称取25g样品置盛有225ml0.85%的无菌生理盐水内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有0.85%的无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品。

（2）液体样品，以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml0.85%的无菌生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

4.4.1.2用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。

4.4.1.3按4.4.1.2操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或吸头。

4.4.1.4根据对样品污染状况的估计，选择2 个-3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。

4.4.1.5及时将15 mL-20 mL 冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 4.4.2培养：

4.4.2.1样品提取：琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃ 培养48h±2h 。

4.4.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按4.4.1.1条件进行培养。 4.4.3菌落计数：

4.4.3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（ CFU ）表示。

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4.4.3.2选取菌落数在30 CFU-300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

4.4.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。

4.4.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

4.5 结果计算：

4.5.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。

4.5.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：

NC(n10.1n2)d

式中：N——样品中菌落数；

C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）； 示例： 稀释度 菌落数（CFU) 1:100（第一稀释度） 232,244 232244333524727 -2[2(0.12)]101:1000（第二稀释度） 33,35 NC(n10.1n2)d

4.5.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4.5.4 所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀

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释倍数计算。

4.5.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

4.5.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU-300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。