HPLC同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量

大理学院学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＤＡＬＩ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　第１１卷第６期２０１２年６月　Ｖｏ１．１　１　Ｎｏ．６　Ｊｕｎ．　２０１２　ＨＰＬＣ同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量　周　萍，周　浓，张海珠　（大理学院药学与化学学院，云南大理６７１０００）　［摘要］目的：建立同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷含量的高效液相色谱方法。方法：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｅｘｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ—Ｃ　柱（４．６　ｍｍｘ２５０　ｍｍ，５　ｔｘｍ）；柱温为２５　ｏＣ；流动相为甲醇一０．２％磷酸水溶液（４５：５５）；流速为１．０　ｍＬ・ｍｉｎ　；检测波长为２６５　ｎｍ。结　果：盐酸小檗碱在１．０２～２Ｏ．４０　ｇ・ｍＵ　内线性关系良好（ｒ＝０．９９９　９）；黄芩苷在４．５４～９０．８０　ｔｘｇ・ｍＬ－　内线性关系良好（ｒ＝０．９９９　８）；盐　酸小檗碱、黄芩苷平均加样回收率为９９．２％，１０１－２％，ＲＳＤ分别为１．１％和１．６％。结论：本方法简便、准确，重现性好，可用于本制剂　的质量控制。　［关键词］高效液相色谱法；明目上清片；盐酸小檗碱；黄芩苷　［中图分类号］Ｒ９１７［文献标志码］Ａ【文章编号］１６７２—２３４５（２０１２）０６—００１２—０４　Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｂａｉｃａｌｉｎ　ｉｎ　Ｍｉｎｇｍｕｓｈａｎｇｑｉｎｇ　Ｔａｂｌｅｔｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ＺＨＯＵ　Ｐｉｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｎｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｈａｉｚｈｕ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄａｌｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉ，Ｙｕｎｎａｎ　６７　１０００，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｅｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｂａｉｃａｌｉｎ　ｉｎ　Ｍｉｎｇｍｕｓｈａｎｇｑｉｎｇ　ｔａｂｌｅｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＨＰＬＣ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｗｉｔｈ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｅｘｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ—Ｃｌ８（４．６　ｍｍｘ２５０　ｍｍ，５　ｔｘｍ），ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｔ　２５。Ｃ，ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ一０．２％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ（５５：　４５），ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ａｔ　１．０　ｍＬ・ｍｉｎ～，ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ａｔ　２６５　ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　１．０２—２０．４０　ｇ・ｍＬ　（ｒ＝０．９９９　９）ｆｏｒ　ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　ａｎｄ　４．５４—９０．８０　ｇ’ｍＬ　（ｒ＝０．９９９　８）ｆｏｒ　ｂａｉｃａｌｉｎ，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｗｅｒｅ　９９．２％（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ＲＳＤ＝Ｉ．１％）ａｎｄ　１０１．２％（ＲＳＤ＝Ｉ．６％）．Ｃｏｎｃｌｓｉｕｏｎ：　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ａｂｏｖｅ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｍｉｎｇｍｕｓｈａｎｇｑｉｎｇ　ｔａｂｌｅｔｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ＨＰＬＣ；Ｍｉｎｇｍｕｓｈａｎｇｑｉｎｇ　ｔａｂｌｅｔｓ；ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｂａｉｃａｌｉｎ　明目上清片是由黄芩、黄连、当归、陈皮、栀子、　连翘、菊花、蒺藜等２１味中药材经加工制成，具有清　热散风、明目止痛的功效，用于暴发火眼。现收录于　建立了同时测定明目上清片中黄连、黄芩中的盐酸　小檗碱和黄芩苷含量的高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）。　结果表明该方法简便、灵敏、快速、准确，减少了检验　成本，降低工作量，为该药的质量控制提供了依据。　《中国药典）２０１０年版第一部［１］，测定黄连中的盐酸　小檗碱作为含量控制指标。有文献报道测定明目上、　１仪器与试药　１．１仪器　Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｅ高效液相色谱仪（美国　Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＡＳ２０５００ＢＤＴ超声波清洗器（天津奥特　塞思斯仪器有限公司）；ＦＡ２００４Ｎ电子天平（梅特　清片中黄芩苷的含量　及橙皮苷的含量ｒ３］，但复方　中药制剂只测量一种指标成分并不能有效地控制　药品的内在质量。中药制剂中同时测定盐酸小檗碱　和黄芩苷两种成分含量已有报道ｒ４引，由于不同制　剂所含药材及辅料不同，产生的干扰不同。本实验　勒一托利多仪器（上海）有限公司）；超纯水仪（成都　唐氏康宁科技发展有限公司）。　７２　总第１０２期　周萍，周浓，张海珠ＨＰＬＣ同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量　第１１卷　１．２药品与试剂盐酸小檗碱、黄芩苷对照品（含　量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号分　别为：１１０７１３—２００８０５，１１０７１５—２００５１４）。明目上清　片为市售品（批号：０９０３０１，０９０５０１，２００９０９０１）；甲　醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。　２方法与结果　２．１色谱条件　色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｅｘｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ—Ｃ】８柱（４．６　ｍｍ￣２５０　ｍｉＴｌ，５　Ｉ．ｚｍ）；流动相：甲醇一　０．２％磷酸水溶液（４５：５５）；流速：１．０　ｍＬ・ｍｉｎ　；柱温：　２５℃；进样量：１０　Ｌ；检测波长：２６５　ｎｍ。　２．２溶液制备　２．２．１　对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱　和黄芩苷对照品适量分别置１０　ｍＬ量瓶中，加甲醇　稀释至刻度，摇匀，得各自的对照品溶液，精密量取　各对照品溶液适量置５０　ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至　刻度，摇匀，得盐酸小檗碱０．２０４　ｍｇ・ｍＬ。和黄芩苷　０．９０８　ｍｇ・ｍＬ－　的混合对照品溶液。　２．２．２供试品溶液制备取明目上清片２０片，去包　衣，研细，取约０．４　ｇ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精　密加入盐酸一甲醇（１：１００）混合溶液５０　ｍＬ，称定重　量，超声处理３０　ｒａｉｎ，放冷，再称定重量，用盐酸一甲　醇（１：１００）混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，临用　前以０．４５　Ｉｘｍ微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。　２．２．３　阴性对照溶液制备按处方比例，分别称取　除黄连、黄芩以外的其余药味，依照明目上清片的　制备工艺制成相应的阴性样品，再按“２．２．２”项下操　作，制成盐酸小檗碱、黄芩苷阴性对照溶液。　２．３系统适用性试验分别取对照品溶液、供试品　溶液、阴性对照液，按“２．１”项下色谱条件测定。两组　分色谱峰与相邻其他色谱峰的分离度均大于１．５，理　论塔板数按盐酸小檗碱计算大于６　０００，按黄芩苷计　算大于４　０００，阴性对照对样品测定无干扰。对照品、　样品及阴性对照色谱图，见图１。　２．４线性关系考察依次精密吸取混合对照品溶　液０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０　ｍＬ于１０　ｍＬ量瓶　中，用稀盐酸一甲醇（１：１）稀释至刻度，摇匀，得系列　质量浓度的溶液，按上述色谱条件进样１０　Ｌ分析，　记录色谱峰面积。以色谱峰面积】，为纵坐标，对照品　１３　ｌ　４　Ａ　ｌ　Ｊ　　ＩＣ　饥』　～～、一一　图１　盐酸小檗碱和黄芩苷的ＨＰＬＣ图　注：Ａ，对照品；Ｂ，明目上清片；Ｃ，缺黄芩阴性样品；Ｄ，缺黄连　阴性样品；１，盐酸小檗碱；２，黄芩苷。　浓度　（　ｇ・ｍＬ　）为横坐标，绘制标准曲线。结果表　明：盐酸小檗碱的质量浓度在１．Ｏ２～２０．４０　ｇ・ｍＬ　内　与峰面积线性关系良好，回归方程为：】，＝３０　３６４Ｘ＋　２７　０５４，ｒ＝０．９９９　９。黄芩苷的质量浓度在４．５４—９０．８０　Ｉｘｇ・ｍＬ　内与峰面积线性关系良好，回归方程为：】，＝　３６　５３８Ｘ＋５４　８６２，ｒ＝０．９９９　８。　２．５仪器精密度试验取同一混合对照品溶液在　上述色谱条件下重复进样６次，盐酸小檗碱和黄芩　苷峰面积的ＲＳＤ分别为０．６９％和１．２％。　２．６重复性试验取同一批样品（批号：０９０３０１），　按“２．２．２”项下的方法平行制备６份供试品溶液，按　“２．１”项下色谱条件进样分析，盐酸小檗碱和黄芩苷　含量平均值分别为２．１５７　ｍｇ・ｇ～，８．１０２　ｍｇ・ｇ～，ＲＳＤ　分别为０．９８％、１．１％。　２．７供试品溶液稳定性试验取同一供试品溶液，　分别于０、２、４、６、８　ｈ按“２．１”项下色谱条件进样分　析，盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积的ＲＳＤ分别为１．２％　和１．４％，结果表明供试品溶液在８　ｈ内稳定性良好。　２．８加样回收试验分别称取已知含量的样品（批　号：０９０３０１）０．２　ｇ，共９份，按低、中、高质量浓度分别　加入盐酸小檗碱、黄芩苷对照品，按“２．２．２”项下的　方法制备供试品溶液，按“２．１”项下色谱条件测定，　计算回收率，结果见表１、２。　总第１０２期医学　大理学院学报　表２黄芩苷加样回收率试验结果　２．９样品测定取“１．２”项下不同厂家生产的样　表３盐酸小檗碱、黄芩苷含量测定结果（ｎ＝３）　品，每批取３份，按“２．２．２”项下的方法制备供试品溶　液，按“２．１”项下色谱条件测定，计算各组分含量。测　定结果见表３。　３讨论　本实验提取溶剂的考察方法为，分别选取甲　醇、７０％甲醇、７０％乙醇、盐酸一甲醇（１：１００）为溶剂，　酸小檗碱峰面积明显小于以盐酸一甲醇作提取溶剂　对同一样品超声提取３０　ｍｉｎ，比较待测化合物的峰　面积，结果表明提取溶剂为甲醇和乙醇时，所得盐　的峰面积，而黄芩苷色谱峰峰面积的差别不大。本　实验考察了超声２０、３０、４０　ｍｉｎ３个时问点，发现超声　Ｔ４　总第１０２期　周萍，周浓，张海珠ＨＰＬＣ同时测定明目上清片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量　第１１卷　３０　ｒａｉｎ，２种指标成分能够提取完全。因此，本实验样　品的制备条件以盐酸一甲醇（１：１００）为提取溶剂，超　声３０　ｍｉｎ。　紫外扫描显示盐酸小檗碱最大吸收波长为　２２３、２６５、３４５　ｎｍ处，黄芩苷最大吸收波长为２７６、　３２４　ｎｍ。由于黄芩苷含量高于盐酸小檗碱，本实验　选择盐酸小檗碱的最大吸收波长２６５　ｎｍ为检测波　长，实验结果表明黄芩苷峰面积在２６５　ｎｍ和２７６　ｎｍ　检测结果无明显差别。在２６５　ｎｍ波长下能同时检测　盐酸小檗碱和黄芩苷，并保证两成份有适宜的灵敏　度。　本实验根据文献报道，分别选用乙腈－０．１　ｔｏｏｌ－Ｌ－１　磷酸二氢钾（３：７）、乙睛一甲醇一０．０５　ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢　钠溶液一三乙胺（２５：７：７６：０．２３，以磷酸调ｐＨ３．１）、甲　醇一水一冰醋酸一三乙胺（３４：６０：６：０．２）、甲醇一０．５％磷　酸溶液、甲醇一水（含０．０５％磷酸和０．１％三乙胺）、甲　醇一０．０５　ｔｏｏｌ・Ｌ　磷酸二氢钾一冰醋酸（４０：６０：１）［　等　作为流动相，分别采用各文献中等度或梯度两种洗　脱方式，发现盐酸小檗碱与干扰成分分离效果不理　想或两目标成份出峰时间太长。经摸索，最终选择　流动相为甲醇一０．２％磷酸（４５：５５）时，盐酸小檗碱和　黄芩苷在２０　ｍｉｎ内出峰，其他成分不干扰，分离度　好，且节约实验成本。　［参考文献］　［１］国家药典委员会．中国药典一部［ｓ］．北京：中国医药科技　出版社．２０１０：８１４．　［２］袁汀，郝延军．高效液相色谱法测定明目上清片中黄芩苷　含量［Ｊ］．山西医药杂志，２００９，３８（１０）：９６３—９６４．　［３］柴金苗．高效液相色谱法测定明目上清片中橙皮苷的含　量ＥＪ　３．中国中医药信息杂志，２０１０，１７（１２）：４３—４４．　［４］胡春丽，王冬梅，张鹏，等．ＲＰ—ＨＰＬＣ法同时测定当归龙荟　片中黄芩苷、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量［Ｊ］．药物　分析杂志，２００８，２８（１２）：２０１１－２０１４．　［５］梁盈军，舒洁倩．ＨＰＬｃ法测定黄连解毒汤传统汤剂与配　方颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷含量的研究［Ｊ］．中国现　代药物应用，２０１１，５（４）：１４—１５．　［６］胡茂华，钟玲，黄小玉，等．ＨＰＬＣ＇￣同时测定蓝芩口服液　中盐酸小檗碱与黄芩苷的含量［Ｊ］．重庆医科大学学报，　２００９，３４（２）：２１０—２１１．　［７］张婷，周平兰．ＨＰＬＣ￣４定复方芩柏颗粒中黄芩苷和盐　酸小檗碱含量［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００９，２０（４）：　３４９－３５１．　［８］马群，艾路，刘勇，等．安宫牛黄丸中栀子苷、黄芩苷和盐　酸小檗碱含量测定研究［Ｊ］冲国中药杂志，２００９，３４（２０）：　２６４７－２６４８．　［收稿日期］２０１１－１１－１８　［修回日期］２０１２—０３—２７　［作者简介］周萍，教授，主要从事药物质量控制研究．　（责任编辑毛本勇）