_葡萄糖苷酶的研究进展

α-葡萄糖苷酶的研究进展

胡先望，杨

摘

震，陈朋，梁宁，严晓娟

（甘肃省商业科技研究所，甘肃兰州730020）

要：α-葡萄糖苷酶（EC3．2．1．20）因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重

视．α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的1，4-l，6-α-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应．研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益．关键词：

α-葡萄糖苷酶；淀粉水解；转糖苷反应；研究进展

+

0366（2011）01-0143-06中图分类号：Q556．2文献标志码：A文章编号：1004-

ProgressinResearchonα-Glucosidas

HUXian-wang，YANGZhen，CHENPeng，LIANGNing，YANXiao-juan

（GansuInstituteofBusinessandTechnology，Lanzhou730020，China）

Abstract：

glucosidas（EC3．2．1．20）playsanimportantroleincommercialstarchprocessing．Theenzymehasα-distinctadvantagesinmanyindustrialprocesses．Muchinformationaboutpresentingα-glucosidasfromavarietyof

organismsandmicro-organismshasbeenreported．α-Glucosidashydrolyzesterminalnon-reducingα-1，4-glucosidic

linkagesofoligo-andpolysaccharidesandactsonα-l，6-glucosidiclinkagesofstarch．α-Glucosidasalsocatalysestransglucosylationreactionswhenhighconcentrationsofglucosylacceptorarepresentinthereactionsystem．Re-searchonthediversifiedapplicationsofα-glucosidasshowithasgreatpotentialsforcommercialdevelopmentand

socialbenefit．Keywords：

glucosidas；hydrolysisofstarch；transglucosylationreaction；progressinresearchα-员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来

α-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益．

生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持．淀粉水解酶（包括转化酶）是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖和水解多糖的水解酶类．同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链

［1］

接方式．淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物

1α-葡萄糖苷酶简介

Glucosidases或α-葡萄糖苷酶（EC3．2．1．20，α-D-GlucosideGlucohydrolase）为淀粉水解酶类中的α-一种，主要在细胞外起作用．它从多糖的非还原末端D-水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-葡萄糖，通常

把它们归类于水解酶第3类，主要水解二糖、低聚

［6］糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物．同时，

1，4-它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的α-糖苷

根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物

［2，3］

．特别是具有特殊性质和新的应用利用碳源等

领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛

［4］［5］

应用于食品和发酵工业、化学工业及医学应用等．α-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一

1，6-键转化成α-糖苷键或其他形式的链接

［7］

，从而

09-09收稿日期：2010-（GKSO41-B01-01）；甘肃省酶制剂生产技术和应用研究创新团队（098TTCA013）项目基金项目：甘肃省技术研究与开发项目（0912TCYA025）、

144

甘肃科学学报2011年第1期

得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等．按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家．α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对—硝型．Ⅰ型α-族

D-基苯酚-α-葡萄糖吡喃苷（pNPG），且水解速率比

低聚麦芽糖快．Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低．Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样

［9］［8］

2α-葡萄糖苷酶来源及分布

α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性

几乎存在于所有生物体内．目前已经进行研质各异，

究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大

多数均来自于微生物中．细菌、霉菌及酵母菌等一些

［10］菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产

．

表1

所得．历年来研究较多的α-葡萄糖苷酶见表1．

部分α-葡萄糖苷酶来源及性质

分子量/kDa约1003278

最适pH5．13．1～3．8

温度/℃

麦芽糖麦芽糖淀粉低聚麦芽糖低聚麦芽糖

6．0

淀粉和肝糖原麦芽糖

243110（二亚基酶）

12065

7．57．07．06．55．0～5．5

4075756060606065

异麦芽糖、黑曲霉素直链淀粉、麦芽低聚糖淀粉麦芽糖麦芽糖

6糖）、低聚麦芽糖（2-异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖低聚麦芽糖、糊精、松二糖低聚麦芽糖支链淀粉

麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖、海藻糖

pNPG、肝糖、淀粉、低聚糖（10糖以下）麦芽糖麦芽糖

105．4

低聚麦芽糖右旋糖

110（二亚基酶）

93

7．57．06．0

9010070

麦芽糊精支链淀粉麦芽糖

底物专一性

来源植物

Grapeberries（葡萄）Sweetcorn（甜玉米）

种类

Maltedbarley（大麦麦芽）Spinachseeds（菠菜种子）Riceseeds（稻谷）

动物

Drosophilamelanogaster（黑腹果蝇）Aplysiafasciata（海兔）

Entamoebahistolytica（痢疾阿米巴）

微生物

Bacillussubtilis（枯草杆菌）Bacilluscereus（蜡状芽孢杆菌）Bacillusamylolyticus（溶淀粉芽孢杆菌）Bacillusstearothermophilus（嗜热脂肪芽孢杆菌）Clostridiumthermohydrosulfuricum（嗜热硫化氢

梭状芽孢杆菌）

Geobacillus（地衣芽孢杆菌）

deep-seaGeobacillus（深海地衣芽孢杆菌）Aspergillusniger（黑曲霉）

Aureobasidiumpullulans（出芽短梗霉菌）Aspergillusniveus（霉白曲霉）

6．8

6574

9．04．23．0～6．0

56

6．0

65

Saccharomycescarlsbergensis（啤酒卡尔斯伯酵母）Saccharomycescerevisiae（啤酒酵母）Saccharomycopsisfibuligera（扣囊复膜酵母）Thermomyceslanuginosus（疏棉状嗜热丝孢菌）Thermotogamaritim（海栖热袍菌）Thermococcus（嗜热古菌）

Thermoanaerobactertengcongensis（嗜热厌氧菌）

3微生物α-葡萄糖苷酶研究现状

它们所产生的α-葡萄糖苷酶性质差异也较大．例

如，枯草杆菌属的不同α-葡萄糖苷酶分子量一般在65～120kDa，有些属酸性水解酶，有些属中性水解酶，最适温度各异，底物专一性也不尽相同，有的主要降解直链淀粉、有的水解麦芽糖和低聚麦芽糖、有

微生物来源的α-葡萄糖苷酶相对分子量一般

在50～120kDa之间．不同来源的α-葡萄糖苷酶的

相性质则差异很大．同一种属的微生物，除少数外，

第23卷胡先望等：α-葡萄糖苷酶的研究进展

145

的具有较宽的底物专一性，可水解多种底物．不同的嗜热菌产生的α-葡萄糖苷酶，分子量差异较大，嗜最高可达到100℃．不同来源的热温度低的为65℃，

α-葡萄糖苷酶部分性质见表1．以下介绍几种主要微生物α-葡萄糖苷酶的研究状况．

3．1枯草杆菌α-葡萄糖苷酶

1991年Bradley等研究了嗜热枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和热溶芽孢杆菌（Bacilluscaldolyti-［11］

cus）α-1，4-葡萄糖苷酶．2种酶均具有胞内低聚-l，4-还原末端专一性水解麦芽糖和α-葡聚糖的α-糖

苷键．它的核苷酸序列推断为1665个碱基对，由555个残基组成，分子量为6．52kDa．此酶与蜡状芽

嗜热葡萄糖苷酶孢杆菌（Bacilluscereus）ATCC7064、

地衣芽孢杆菌（Bacillusthermoglucosidasius）KP1006、

卡尔斯伯酵母（Saccharomycescarlsbergensis）CBll、枯枯草杆菌（Bacillussp．）草杆菌（Bacillussp．）F5、

SAM1606等的葡萄糖苷酶和变性链球菌（Streptococ-cusmutans）的右旋葡萄糖苷酶及大肠杆菌（Esche-α-葡萄糖苷酶活性，经薄层分析，它们水解直链低聚

麦芽糖产生麦芽糖和葡萄糖，并水解普鲁兰．二者均

不水解pNPG、

麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖或潘糖．2种酶均由二亚基组成，分子量分别为55kDa和

60kDa，最适pH分别为7．5和7．0，对底物p-硝基-α-D-麦芽糖苷的Km分别为2．96mM和1．31mM．他们在1993年进一步研究了嗜热芽孢枯草杆菌转

化株（H-17）α-葡萄糖苷酶［12］

．此酶为胞内酶，具有水解低聚-

l，4-糖苷键活性，也可水解直链麦芽低聚糖产生麦芽糖和葡萄糖，同时还具有普鲁兰酶活性，

水解普鲁兰产生麦芽糖、葡萄糖及（异构）潘糖．此酶对pNPG、麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、（异构）潘糖无活性，但对淀粉有轻微的水解作用．原酶为二亚基，亚基分子量为5．5kDa，等电点pI4．8，最适pH7．5，5mMTris-HC1溶液可80%抑制其活性，对p-硝基苯酚-α-D-麦芽糖苷Km值为1．46mM．最适酶活力温度65℃，其嗜热活性需要最低浓度0．02%的巯基乙醇或0．005mM的EDTA．氨基酸分析发现H-17株产生的酶与枯草杆菌2S产生的酶相比，前者具有较多数量的疏水氨基酸残基，是酶热稳定性和水解活性增加的原因．3．2出芽短梗霉菌胞内α-葡萄糖苷酶

出芽短梗霉菌（Aureobasidiumpullulans）可产生

胞内α-葡萄糖苷酶，

1993年Badal等［13］将此酶经TritonX-100溶解、Q-Sepharose处理，羟磷灰石、辛基—琼脂糖柱层析、

SephacrylS-200（丙烯葡聚糖凝胶）过滤可纯化124倍，酶活达到316．82U/mg蛋白．在50℃时最适pH4．0，稳定pH范围3．0～6．0，在60℃时稳定，最适活力温度为60℃．部分纯化的酶分解麦芽糖、异麦芽糖、蔗糖和海藻糖，水解相对速率分

别为100，60，47，和50，对多聚糖无活性或活性很低，酶活性不需要金属离子参与．

3．3芽孢杆菌α-葡萄糖苷酶

Takii等［14］研究的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）ATCC12016α-葡萄糖苷酶可从非

richiacoli）ECLll6的海藻糖6-磷酸水解酶具有40%～57%的序列相似性．所有这些酶均显示出于蜡状芽孢杆菌（B．cereus）葡萄糖苷酶相似的X衍射二级结构．他们认为此酶位于N-端的一个活性中心，为

（α/β）8桶状折叠结构．

2009年Arzu等［15］对地衣芽孢杆菌（Geobacillussp．）A333和嗜热菌A343的嗜热α-葡萄糖苷酶性质进行了研究．他们从地衣芽孢杆菌A333和嗜热菌A343中部分纯化分离出2种嗜热的α-葡萄糖苷酶．

A333的α-葡萄糖苷酶最适温度60℃、pH6．8、对pNPG底物的Km值为1．38mM．A343α-葡萄糖苷

酶最适温度65℃、

pH8．5．通过20种底物专一性和薄层层析分析证明A333α-葡萄糖苷酶具有较高的转糖苷活性，

而A343α-葡萄糖苷酶有较宽的底物专一性．A333α-葡萄糖苷酶底物为麦芽糖、糊精、松二

糖、麦芽三糖、麦芽戊糖、麦芽四糖、麦芽六糖、苯基葡萄糖吡喃苷．A343α-葡萄糖苷酶更多的水解糊精、松二糖、麦芽糖、苯基葡萄糖吡喃苷、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽六糖、异麦芽糖、蔗糖和曲二糖等的α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6键．60℃保温5h，A333和A343的活性保留分别为83%和92%．经试验测试它们能抵抗许多变性剂、抑制剂和金属离子．2种α-葡萄糖苷酶的转糖苷活性和淀粉水解能力均具有潜在的开发价值．

深海地衣芽孢杆菌（Geobacillussp．）HTA-462是从深海淤泥中分离出的海洋微生物，它的α-葡萄糖苷酶是一种具有潜在生物合成碳水化合物

的酶，2005年Hung等［16］对此酶进行了分离，并经SDS-PAGE电泳得到一种蛋白，分子量65kDa．在低离子强度下为二聚体（分子量130kDa）．它嗜热、耐碱，在最大水解条件下（60℃、pH9．0，溶于15mM

甘油-NaOH缓冲液）半衰期为13．4h．此酶在胞外专一性水解低聚糖的α-1，4糖苷键，具有很强的转

糖苷作用，

当麦芽糖存在时，能对非糖分子进行糖基化．它可将麦芽糖转化为异麦芽糖．编码此酶的基因

146

甘肃科学学报2011年第1期

已被克隆和测序．重组酶在枯草杆菌胞外生产，并保留了原酶的性质．定点突变实验显示除Asp199，Asp326和Glu256外，Asp98对于酶活性也是必需的．

嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌（Clostridiumthermo-hydrosulfuricum）39E可产生一种细胞结合性α-葡萄糖苷酶，发酵粗酶通过曲拉通100溶解、硫酸铵沉

DEAE-SepharoseCL-6B、octyl-Sepharose（辛基琼淀、

acarbose-Sepharose（阿卡波糖琼脂脂糖凝胶）层析、

淀粉、支链淀粉依次降低．对低聚糖，此酶可水解麦

芽低聚糖（G10以下）、麦芽戊糖、麦芽四糖、麦芽三海藻糖和β-环麦糖和麦芽糖．微弱水解异麦芽糖、

不水解蔗糖和α-环麦芽糊精．此酶水解淀芽糊精，

粉2h后用HPLC和薄层分析显示产物只有葡萄糖．质谱分析此酶与烟曲霉（Aspergillusfumigatus，一种海洋真菌）、红褐肉座菌（Hypocreajecorina，从前称4-为里氏木霉Trichodermareesei）的葡聚糖1，α-葡萄糖苷酶相似．园二色光谱分析（二级结构分析）显示糖凝胶）亲和层析等纯化140倍．此酶的最适作用

温度75℃，半衰期75℃时为35min、70℃时为110min、60℃时为46h．酶稳定pH5．0～6．0，最适

pH5．0～5．5．水解麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽六糖的α-l，4-糖苷键，速率随糖的聚合度的增加而降低．此酶也可水解异麦芽糖和异麦芽三糖的α-l，6-糖苷键，对pNPG的水解速度快．在pH5．5和60℃时对麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、麦芽三糖和pNPG的Km值分别为1．85mM，2．95mM，1．72mM，0．58mM和0．31mM，水解产物均为葡萄糖．酶活性无需金属离子参加，可被阿卡波糖

抑制［17］

．3．4

曲霉α-葡萄糖苷酶

黑曲霉（Aspergillusniger）在以木薯淀粉为碳源

的培养基中可产生2种葡萄糖淀粉水解酶：α-

葡萄糖酶和α-淀粉酶．2种酶经硫酸铵沉淀、离子交换层

析和2次凝胶过滤层析可纯化为2种纯酶，葡萄糖淀粉酶1和葡萄糖淀粉酶2，分子量分别为74kDa和96kDa，等电点pI分别为3．8和3．95，最适pH则分别为4．2和4．5，稳定pH范围3．5～9．0．这2种酶均有嗜热性，最适温度分别为60℃和65℃，在60℃时酶活性可稳定1h．酶动力学分析表明，2种

酶水解支链淀粉均比直链淀粉更有效［18］

，说明2种酶均具有α-葡萄糖苷酶的水解活性．霉白曲霉（Aspergillusniveus）产生胞外α-葡萄

糖苷酶可用DEAEFractogel（交联的聚甲基丙烯酸

树脂）离子交换层析和SephacrylS-200（丙烯葡聚糖凝胶）过滤进行纯化［19］

．纯化蛋白经5%的PAGE

和10%的SDS-

PAGE电泳显示为单带．此酶表现出29%糖基化，等电点pI6．8，

SDS-PAGE测定分子量52kDa，Bio-Sil-Sec-400测定分子量56kDa．此酶呈现典型的α-葡萄糖苷酶活性，水解p-硝基-α-D-葡萄糖吡喃苷，最适pH6．0，最适温度65℃．在底物不存在时，纯化酶60℃可稳定60min，在65℃时的半衰期为90min．水解多聚糖的活力按肝糖、直链淀粉、

此酶二级结构为31%α-螺旋，16%β-折叠，与红褐肉

座菌酶的α-葡萄糖苷酶晶体结构分析一致．3．5

酵母α-葡萄糖苷酶

Eva等［20］报道了扣囊复膜酵母（Saccharomycop-sisfibuligera）α-葡萄糖苷酶的cDNA克隆及表达产

物的性质研究．α-葡萄糖酶cDNA设定为2，886碱基对，包括N-末端编码19氨基酸信号肽的开放阅

读框和编码944个氨基酸的成熟蛋白序列，蛋白预测分子量为105．4kDa，

pI值为4．52，并推断此氨基酸序列与2种酵母（Schwanniomycesoccidentalis，Candidaalbicans）的葡萄糖水解酶有70%的同源性．重组的表达产物（在啤酒酵母中表达）专一性水解麦芽低聚糖，

不水解可溶性淀粉．早期人们已对啤酒酵母（Saccharomycescerevisi-ae）、卡尔斯伯酵母（Saccharomycescarlsbergensis）等

的α-葡萄糖酶进行了研究［21，22］

．3．6

其他微生物的α-葡萄糖苷酶

疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyceslanuginosus）

在生长过程中可用右旋糖作为碳源，它们在早期的

发育过程中能产生一种具有降解右旋糖的α-葡萄糖苷酶．酶活高峰期在培养22h后出现，在菌种培养的稳定期，由于其他蛋白酶的影响，酶的活力极快地降低．此酶是一种高活性的水解葡聚糖苷的α-葡

萄糖苷酶［23］

．

白色念珠菌（Candidaalbicans）α-葡萄糖苷酶Ⅰ

和Ⅱ为胞内定位酶，参与N-端葡聚糖连接中心Glc3Man9GlcNAc2（简称G3M9）形成，α-葡萄糖苷酶I修饰G3M9上的α1，2-葡萄糖单位，产生中间体Glc2Man9GlcNAc2．此中间体接着被α-葡萄糖苷II

催化，切除最后2个α-1，3-葡萄糖残基产生Man9GlcNAc2．2种α-葡萄糖苷酶在糖基化过程中均

起联合降解作用，此作用为糖蛋白折叠质量控制机

制．Mar'a等［24］对白色念珠菌α-葡萄糖苷酶Ⅰ的CaCWH41的30-end基因进行了表达，它编码α-葡

萄糖苷酶Ⅰ，并证明此酶活性在N-端葡聚糖连接中

第23卷胡先望等：α-葡萄糖苷酶的研究进展

147

是必需的，同时证明在酶催化过程中，半胱氨酸比组氨酸作用大．

海栖热袍菌（Thermotogamaritima）MSB8的α-葡萄糖苷酶基因可从T．maritima基因文库中用显性筛选法鉴定，此基因定位于一簇基因组中，包括水解淀粉、麦芽糊精、所有水解麦芽低聚糖的基因组．根据此酶的一级结构可推出其基因核苷酸序列，此酶属于水解酶第4家族，在大肠杆菌内重组，该酶纯

［25］化、性质等均已被研究．

检索已报道的各类α-葡萄糖苷酶研究达几十种，日

本、美国、丹麦等国家已实现微生物发酵α-葡萄糖葡萄糖苷酶研究还处苷酶的工业化生产．我国对α-主要集中在第一方面的研究，对酶的结于起步阶段，

构、催化机制、酶应用和酶产品开发等方面的报道很少，更没有工业化α-葡萄糖苷酶的产品，研究和生产用酶基本上全部依赖进口．今后我国α-葡萄糖苷酶的研究和产品开发任重而道远．

杆菌（Bacillussp．）SAM1606α-葡萄糖苷酶的基

因在大肠杆菌中进行同源重组，纯化后的嗜热α-葡

萄糖苷酶为单一的多聚蛋白体，相对分子量6．4kDa，等电点pI4．6．此酶可水解各种类型的O-α-D-葡萄糖吡喃苷，如：黑曲霉素、麦芽糖、异麦芽糖、

蔗糖、海藻糖等，可应用于工业连续生产低聚糖［26］

．热球菌（Thermococcussp．）HJ21所产高温α-葡

萄糖苷酶最适温度为100℃，

80℃培养4h，酶活力保持90%，在90℃保温1h，酶活力保持80%．该酶

合适作用pH为7．0，

在pH5．0～8．0稳定［27，28］

．从嗜热厌氧菌（Thermoanaerobactertengcongensis）MB4

基因克隆表达的α-葡萄糖苷酶最适pH为6．0，最适温度70℃，分子量93kDa，可水解麦芽糖产生葡萄

糖［29］

．此酶可广泛用于化工、纺织、食品、医药工业等方面．

4α-葡萄糖苷酶研究发展趋势

1982年日本林原生化研究所成功筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种，使该酶得以实现工业化规模发酵生产，产品大量应用于淀粉加工业和食品工业．此后，各种新型的α-葡萄糖苷酶及其新的应用受到空前的重视．

从α-葡萄糖苷酶研究的历史进程分析，对它的研究可分为3个方面：①主要集中在生产α-葡萄糖

苷酶的微生物菌种的筛选方面，涉及菌种培养、酶活力提高、酶分离纯化和酶的基本理化性质研究；②集中在酶的氨基酸序列分析、酶的结构分析、酶的催化机理研究等；③集中在酶的应用开发，包括酶的水解底物专一性、酶水解底物的条件和速度、酶催化反应产物及应用开发、新型α-葡萄糖苷酶开发及应用等．

目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于淀粉水解［30］、酒精发酵［31］、低聚异麦芽糖生产［32］、化学合成

［33］

、代谢机理研究［34］

、临床检测和疾病治疗［35］

等领域．国外对α-葡萄糖苷酶的研究较深入，经文献

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作者简介：

），胡先望（1965-男，湖北省仙桃人，甘肃农业大学预防兽医学专业2007级在读博士研究生，省级科研院所学科带头人，

省酶制剂生产技术和应用研究创新团队带头人，现任甘肃省商业科技研究所高级工程师．