测定蛋白质含量常用方法

一，微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 二，双缩脲法（Biuret 法） 三，Folin—酚试剂法（Lowry 法） 四，紫外吸收法

五，考马斯亮蓝法（Bradford 法）

几种方法比较：

方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 灵敏度低，费时 将蛋白氮转（Kjedahl法） 适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 2％ 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1～20mg 中速 多肽键＋碱20~30分钟 性Cu2＋紫色络合物 8～10小时 化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用于标准蛋用三氯乙酸沉白质含量的淀蛋白质而分准确测定；干离） 扰少；费时太长 硫酸铵； 用于快速测Tris缓冲液； 定，但不太灵某些氨基酸 敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 快速 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧用于层析柱啶； 各种核苷酸 流出液的检测；核酸的吸收可以校正 50～100g 5～10分钟 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ≈5g 慢速 双缩脲反40～60 应；磷钼酸－磷钨酸试硫酸铵； 耗费时间长；Tris缓冲液； 操作要严格甘氨酸； 各种硫醇 计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 分钟 剂被Tyr和Phe还原 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm 强碱性缓冲液； 最好的方法； 干扰物质少； TritonX-100; 颜色稳定； SDS 颜色深浅随不同蛋白质变化 五，考马斯亮兰法（bradford法） （一）实验原理

双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。 （二）特点：bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。 此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 （三）试剂与器材 1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材：

（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支 （四）操作方法 1. 标准方法

（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法常用表格：

标准蛋白质 （1.0mg/ml） 未知蛋白质 （约1.0mg/ml） 蒸馏水 考马斯亮兰G-250试剂 1 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.02 0.04 0.06 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中蛋白质 量（ug） 光吸收值(A595) （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。 参考文献

【1】 Boyer, Rodney F. Modern experimental biochemistry 1986, :55-59 【2】 Krishnaraj PU,Gloning of a Serra Lia marcescens DNA fragment that induces qninoprotein glucose dehydrogenase-mediated gluconic acid production in Escherichia coli in the presence of station-ary phase Serra marcescens[J].FEMS Microbiol Lett,2001,205（2）：205-215