pta基因敲除对L_色氨酸发酵的影响[1]

2021-01-24 来源：乌哈旅游

ResearchPaper微生物学报ActaMicrobiologicaSinica51（4）：480－487；4April2011ISSN0001－6209；CN11－1995/Qhttp：//journals.im.ac.cn/actamicrocn

研究报告pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响

1111121*

黄静，史建明，刘倩，徐庆阳，谢希贤，温廷益，陈宁

天津科技大学生物工程学院，教育部工业微生物重点实验室，天津中国科学院微生物研究所，北京

100101

300457

摘要：【目的】探究pta基因缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响。【方法】运用Red重组技术敲除pta基因，构建pta缺失株E.coliTRTHΔpta。利用30L发酵罐进行分批补料发酵试验，考察重组菌E.coli

+TRTHΔpta发酵生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、发酵液中NH4浓度及变化。建立

了大肠杆菌合成L-色氨酸的代谢流平衡模型，应用MATLAB软件计算出E.coliTRTH及其pta缺失株发酵pta缺失株能够以较长时间和较高比生长速率保持中后期代谢网络的代谢流分布。【结果】发酵结果显示，pta缺对数生长，最终菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了52.7%和46.8%。有机酸含量分析结果表明，只有2.5g/L，仅为亲株的19.5%；丙酮酸和乳酸的含量有一定增加。多参数分析失株乙酸含量显著降低，

pta缺失株发酵过程中NH4+浓度较亲株降低33.2%。pta缺失株发酵生产L-色氨酸的代谢流量结果显示，

EMP途径的代谢流量降低7.4%，PP途径的代谢流量增加8.4%，TCA循环的代谢流量降低分析结果表明，

32.2%。【pta基因的缺失导致在发酵生产L-色氨酸过程中代谢流发生变化，结论】乙酸含量的显著降低解使得菌体生物量和L-色氨酸产量大幅提高。除了乙酸对菌体生长和产物生成的抑制，

关键词：Red重组技术，pta基因，基因敲除，乙酸，L-色氨酸中图分类号：Q933

文献标识码：A

6209（2011）04-0480-08文章编号：0001-表达效率，严重地影响大肠杆菌在高密度培养时的生产能力

［4］

作为人和动物必需氨基酸之一的L-色氨酸广食品和饲料工业泛应用于医药、和微生物发酵法

［2］

［1］

。目前利用微生。在工业发酵过程中，为了减少发酵过

物生产L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法

，其中微生物发酵法是大规模生

现常用菌株有大肠杆菌和产L-色氨酸的首选技术，

谷氨酸棒杆菌。由于大肠杆菌具有遗传背景清楚、易培养、发酵周期短并能实现目的基因的高效表达重组大肠杆菌得到广泛应用等特性，

［3］

程中乙酸的积累，通常采用葡萄糖流加发酵工艺，严格控制发酵液中的葡萄糖浓度。但碳源流加工艺不能从根本上消除发酵过程中乙酸的产生，同时还增加发酵过程控制的复杂性及成本支出。利用代谢工程技术构建pta缺失株，能够阻断大肠杆菌培养过降低乙酸的累积水平，减程中乙酸产生的主要通路，

少乙酸对菌体生长的抑制作用，提高L-色氨酸产量，实现大肠杆菌的高密度培养。

。但是在以

葡萄糖为碳源的培养过程中，大肠杆菌会生成并积累乙酸，后者不仅抑制菌体生长，而且降低外源基因

“重大新药创制”）；“十一五”基金项目：国家科技重大专项课题（2008ZX09401－05国家科技支撑计划重点项目（2008BAI63B01）

22-60272182；Fax：+86-22-60602298；E-mail：ningch@tust.edu.cn通信作者。Tel：+86-

作者简介：黄静（1985－），女，硕士研究生，专业方向为代谢控制发酵。E-mail：hhenry.kaka@163.com收稿日期：2010-11-03；修回日期：2010-01-14

黄静等：pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响./微生物学报（2011）51（4）481

大肠杆菌产生乙酸的途径有两条，一是在丙酮酸氧化酶的作用下直接由丙酮酸产生乙酸（PoxB途径），但在大肠杆菌中此酶的活性很低，不足以产生大量的乙酸；另一条是在磷酸转乙酰基酶和乙酸激酶的作用下将乙酰CoA转化为乙酸（Pta-Ack途径），这是大肠杆菌产生乙酸的主要途径

［5］

白胨、酵母粉为Oxoid公司产品；其余试剂均为国产分析纯。MicroPulserElectroporator购自Bio-Rad公司。1.1.4

培养基：①LB培养基，②2-YT培养基，③

SOC培养基，④种子培养基，⑤发酵培养基。其中①6］，②③培养基见参考文献［④⑤培养基见参考文1］。献［1.2

PCR片段的制备

P1、P2为引物，以质粒pKD3为模板，进行PCR94℃变性扩增，反应条件为：95℃预变性3min，1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。用DpnⅠ酶作用PCR产物，并将DpnⅠ作用后的PCR产物用乙醇沉淀法进行回收。1.3

含有pKD46电转感受态细胞的制备

pKD46含有温度敏感型的复制起点oriR101，在

，其中由

pta基因编码的磷酸转乙酰基酶（PhosphatePTA）是该途径中的关键酶。本文以transacetylase，

E.coliTRTH为出发菌，利用Red重组技术敲除pta基因，构建pta缺失株E.coliTRTHΔpta，并研究了pta缺失对细胞生长和L-色氨酸发酵的影响。

1.1

材料和方法

材料

菌株和质粒：E.

coliTRTH/pSV-709

1.1.130℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失。在pKD46上还含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，它们通过L-阿拉伯糖诱导表达，并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。挑取含有pKD46的E.coliTRTH单菌落于5mL2-YT液体培30℃培养12h，养基中，转接2mL过夜培养的菌液至100mL2-YT培养基（氨苄青霉素的浓度为100μg/mL），30℃培养至OD600=0.2－0.3时，加入L-阿拉伯糖（终浓度100mmol/L），继续培养至OD600=0.5－0.6，充分表达pKD46质粒上的Exo、Bet和Gam3个蛋白，9500×g，将菌液于4℃预冷，4℃离心10min，弃上清，用预冷的10%甘油洗涤3次，重悬于600μL10%甘油，每管50μL分装，－80℃保存。1.4

电转化

将同源臂引物扩增的氯霉素抗性基因片段与感25μF，200Ω条件下电于1800V，受态细胞混合，

120r/min，击，电击后迅速加入1mLSOC培养基，37℃培养1－2h之后涂布于含有氯霉素（25μg/mL）抗性的平板上，筛选阳性转化子。1.5

抗性基因及pCP20质粒的消除

37℃将pCP20电转入含氯霉素抗性的重组子，复苏1h，涂布于氨苄青霉素（100μg/mL）抗性平板P4对转化子进行菌落PCR，上。使用鉴定引物P3、

42℃将筛选到的阳性转化子接种于LB培养基中，过夜培养，经划线分离，对每个单菌落进行氯霉素的抗性检测，挑选对氯霉素敏感的克隆，得到消除质粒

（trpEDCBA）、E.coliDH5α，天津科技大学工业微生物菌种保藏室提供；质粒pMD18-Tvector购自大连宝生物工程有限公司。1.1.2

引物：pKD3含有氯霉素抗性基因，且在抗性

基因两侧有FRT位点，在Red重组系统中作为抗性12标记使用。根据GenBank提供的E.coliK-W3110基因序列信息，设计含有56bp同源臂的一P2（划线部分为同源臂），用于对寡核苷酸引物P1、

从质粒pKD3上PCR扩增出含有氯霉素抗性及FRT位点的基因片段；在大肠杆菌染色体pta基因同源P4用于检测重组菌重组区域外侧，设计引物P3、株。P1：5′-GCTGGCGGTGCTGTTTTGTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG-3′；P2：5′-TAGTGATTATTTCCGGTTCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGATAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3′；P3：5′-GTTTCGGCAAATCTGGTTTCATC-3′；P4：5′-TGGTAAGTATGCAAAGTGGGATGG-3′。1.1.3

主要试剂和仪器：TaqDNA聚合酶、限制性

内切酶购于大连宝生物工程有限公司；PCR引物由北京博迈德科技有限公司合成；1kbmarker为Fermentas公司产品；L-阿拉伯糖购自天津艾勒科技发展有限公司；DNA片段回收试剂盒、基因组DNA的提取试剂盒、质粒小样快速提取试剂盒购于北京X-gal、天恩泽基因科技有限公司；IPTG、溶菌酶、氨苄青霉素、氯霉素、四环素购于北京索莱宝公司；蛋

482JingHuangetal./ActaMicrobiologicaSinica（2011）51（4）

pCP20的重组菌株。1.61.7

1］。摇瓶及发酵罐培养见参考文献［分析方法

菌体比生长速率μ、葡萄糖浓度、菌体生物量、

L-色氨酸含量测定见参考文献［1］；乙酸及乳酸浓度采用BioProfile300ANova（美国NovaBiomedical公司）生化分析仪测定；丙酮酸及琥珀酸参照文献［7］进行测定；代谢流平衡模型的建立及代谢流量。利用MATLAB软件的计算参见文献［8－9］linprog函数求得代谢流分布。

L-色氨酸产量、每隔2h测定生物量、及比生长速率结果如图1所示。等参数，

2.1

结果

pta基因缺失株的构建

P1、P2为引物，扩增出两以质粒pKD3为模板，

端与pta基因上下游序列同源、中间为氯霉素抗性的片段。将扩增出的上游同源臂-氯霉素抗性基因-下游同源臂的DNA片段电转入含有质粒pKD46的E.coliTRTH感受态细胞中，37℃复苏1－2h，涂布P4对转化于氯霉素抗性平板。使用鉴定引物P3、

子进行菌落PCR，筛选阳性重组子。pta基因的长度而氯霉素抗性基因的长度为1397bp。为2488bp，

pCP20含有温度敏感型的复制起点，同时带有氨苄青霉素和氯霉素抗性。pCP20上含有一个翻转FLP）基酶重组酶（Flippaserecombinationenzyme，FLP重组酶可以与FRT位点结合，因，在FLP重组FRT位点自身发生同源重组，酶的作用下，从而消除一个FRT位点及抗性基因，重组酶FLP在42℃时诱导表达，同时质粒也逐渐消失。将质粒pCP20电转37℃复苏1－2h，入含氯霉素抗性的重组子，涂布于P4对氨苄青霉素抗性平板上。使用鉴定引物P3、将筛选到的阳性转化子接种转化子进行菌落PCR，

42℃过夜培养，于LB培养基中，经划线分离，对每个单菌落进行氯霉素的抗性检测，挑选对氯霉素敏感的克隆，得到消除质粒pCP20的重组菌株E.coliTRTHΔpta。将重组子E.coliTRTHΔpta使用鉴定P4扩增出的PCR产物经博迈德公司测序，引物P3、

测序结果经DNAMAN软件进行序列对比，与理论一致。这表明我们已经成功获得E.coliTRTHΔpta缺失突变株。2.2

E.coliTRTHΔpta发酵生产L-色氨酸在30L自动控制发酵罐上进行分批补料发酵，

图1

Fig.1

E.coliTRTH及其pta缺失株发酵过程曲线

ThecurveofL-tryptophanfermentationofE.coliTRTHand

itsptamutant.A：GrowthcurveofE.coliTRTHanditsptamutant.B：L-tryptophanproductioncurveofE.coliTRTHanditsptamutant.FilledsymbolsrepresentE.coliTRTH，opensymbolsrepresentE.coliTRTHΔpta.Experimentswereperformedthreetimes，anddatawerepresentedasthemean±SD.Thesameasbelow.

E.coliTRTH及其由图1可知，发酵过程中，pta缺失株在对数生长期存在显著差异。在对数生E.coliTRTH增长较快，长期初期，产酸水平较高；pta突变株的比生长速率超过其对数生长期中后期，

E.coli亲株，菌体迅速增殖，产物大量合成；24h后，TRTH基本进入稳定期，此时pta缺失株的比生长速率和比产酸速率虽然也明显下降，但仍以一定速率pta突变株发酵过程中增长。与E.coliTRTH相比，

对数生长期中后期保持较高的比对数生长期延长，

生长速率和比产酸速率，最终pta缺失株菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了52.7%和46.8%。

黄静等：pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响./微生物学报（2011）51（4）483

2.3E.coliTRTHΔpta发酵过程中有机酸的积累利用液相色谱法对E.coliTRTH及其pta缺失

2.4E.coliTRTHΔpta发酵过程中离子浓度分析利用BioProfile300ANova多参数分析仪对E.

株发酵液的有机酸组成进行分析，结果如图2所示。coliTRTH及其pta缺失株发酵生产L-色氨酸过程

3－

Na+，K+，NH4+离子进行检测，结果如图3中PO4，

所示。

pta缺失株发酵过程中NH4+从图3可以看出，

累积浓度低于亲株，最高只有120.4mmol/L，降低了33.2%。E.coliTRTH及其pta缺失株发酵过程

+－K+和PO3中Na，离子的累积浓度无明显差异。4

2.5pta缺失对代谢流量分布的影响

30L自控发酵罐L-色氨酸发酵过程结果显示，

26h以后菌体量已没有明显变化，认为此后细胞处于非生长时期，假设细胞内部的中间代谢物均处于即其浓度变化速率为0。根据代谢网络以拟稳态，

代谢节点反应速率及各步反应的化学计量平衡式，

方程见表1。从表1可以看出，方程数为20，未知数方程自由度为5，即需测定5个速率方可确定为25，

代谢网络中的流量分配。分别测定E.coliTRTH及其pta缺失株发酵中后期（26－30h）发酵液中的葡L-色氨酸、萄糖、乙酸、乳酸及丙氨酸的胞外浓度，计算各自的消耗或积累速率。利用MATLAB软件可计算E.coliTRTH及其pta缺失株发酵中后期代谢流分布，结果如图4所示。

图2

Fig.2

E.coliTRTH及其pta缺失株发酵生产L-色氨

AccumulationoforganicacidduringL-tryptophan

pta缺失株L-色氨酸合成路径的代从图4可以看出，

谢流增加了7.0%。Glc6P节点代谢流分配结果表EMP途径的代谢流量降低7.4%，PP途径的代明，

谢流增加8.4%。Pyr节点代谢流分配结果显示，TCA循环的代谢流量降低32.2%，乳酸和丙氨酸支路代谢流分别增加0.7%和0.8%，乙酸支路代谢流减少12.2%。

酸过程中有机酸的累积

fermentationofE.coliTRTHanditsptamutant.A：AcetateandsuccinateproductioncurveofE.coliTRTHanditsptamutant.B：LactateandpyruvateproductioncurveofE.coliTRTHanditsptamutant.

E.coliTRTH发酵生产L-色氨酸由图2可知，

大约从2h开始产生乙酸，随着比生长速过程中，

率的增大，乙酸迅速累积，在18h达到最大值12.6g/L，18h后部分乙酸被菌体利用，浓度有所20h下降；pta缺失株大约从6h才开始产生乙酸，达到最大值2.5g/L，仅为亲株的19.5%，随后乙26h后发酵液中几乎未检测到乙酸被迅速消耗，酸。

E.coliTRTH在整个发酵过程中乳酸的累积浓最高只有0.4g/L；pta缺失株从8h开始产度很低，

18h达到最大值4.5g/L，生乳酸，随后乳酸被迅速24h后发酵液中未检测到乳酸。消耗，

3讨论

代谢工程是利用重组DNA技术通过操纵细胞

的酶系、转运及调控功能、有目的地对生化反应的代谢网络进行修饰的技术。基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除等基因操作均会导致细胞中心调控发生变化

［10］

。本文利用Red重组系统成功敲除了大

pta肠杆菌乙酸生物合成途径中的关键酶基因pta，缺失株发酵生产L-色氨酸过程中，乙酸含量显著降低，解除了乙酸对菌体生长和产物生成的抑制，使得菌体生物量和L-色氨酸产量大幅提高。

484JingHuangetal./ActaMicrobiologicaSinica（2011）51（4）

由于大肠杆菌的氧化磷酸化和和三羧酸循环乙酰CoA不能被完全氧化为CO2，过能力的有限，

［11］

。剩的乙酰CoA经Pta-Ack途径生成乙酸

CoA节点分析中指出，积累的乙酰CoA并没有直最终EMP途径和TCA循环的代接进入TCA循环，

PP途径代谢流增强，谢流降低，细胞能量供应充pta基因的敲除对于菌体生物量增大。可见，足，

不同菌株的代谢流迁移是存在显著差异的。本文pta缺失株发酵生产L-色氨酸的代谢流量分析结EMP途径的代谢流量降低7.4%，PP途径果表明，

TCA循环的代谢流量降低的代谢流量增加8.4%，

32.2%。EMP途径流量减小，PP途径流量的增大，表明pta缺失株摄取的葡萄糖更多的用于菌体的生长，因而菌体具有更强的生长能力。

Chang［12］指出，pta基因敲除导致乙酰CoA过量积累，过量的乙酰CoA将直接影响丙酮酸脱氢酶的活性，造成丙酮酸的积累，使得PEP/Pyr比值降EMP途径代谢流减低，降低菌体对葡萄糖的吸收，少；过量积累的乙酰CoA进入TCA循环，使得TCA循环代谢流增加。最终细胞能量供应不足，葡萄糖吸收率降低，致使细胞生长受阻，菌体生物量下降。Sara

［11］

在E.coliBW25113Δpta乙酰

图3

Fig.3

E.coliTRTH及其pta缺失株发酵生产L-色氨酸过程中离子浓度

Concentrationofsodium，potassium，ammoniumandphosphateduringL-tryptophanfermentationofE.coliTRTHanditsptamutant.A：

SodiumconcentrationofE.coliTRTHanditsptamutant.B：PotassiumconcentrationofE.coliTRTHanditsptamutant.C：AmmoniumconcentrationofE.coliTRTHanditsptamutant.D：PhosphateconcentrationofE.coliTRTHanditsptamutant.

黄静等：pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响./微生物学报（2011）51（4）

表1

Table1

MetabolicnodeGlc6PF6PGAPP3GPEPPyrAcCoAα－KGOAARu5P

Reactionrateequationr1－r2－r11=0r2－r3+r15－r16=0

2r3－r4+r14－r15－r16+r22=0r4－r5－r19=0

r5－r1－r6－r10－2r17=0r1+r6－r7+r22－r23－r25=0r7－r8－r24=0

r8－r9－r18+r19+r25=0r9－r8+r10=0r11－r12－r13=0

485

代谢节点反应速率方程

MetabolicnodeX5PR5PS7PE4PChoGluGlnPRPPSerNADPH

Reactionrateequationr12－r14+r16=0r13－r14－r21=0r14－r15=0r15+r16－r17=0r17－r22=0

r18－r19－r20+r22－r25=0r20－r22=0r21－r22=0r19－r22=02r11－r17－r18=0

Reactionrateequationofmetabolicnodes

图4

Fig.4

E.coliTRTH及其pta缺失株（括号内）色氨酸合成代谢流分布

MetabolicfluxofL－tryptophanfermentationofE.coliTRTHanditspta

mutant（valuesinbrackets）.

LuliGW

［13］

指出，质子化的乙酸可以穿过细胞Buurman外，

［14］

等对大肠杆菌的研究发现，在高浓度

－+

质膜进人胞内，在胞内解离成CH3COO和H。结+

降低了胞内的pH值。大肠杆菌需要果使H内流，

消耗ATP将H泵到胞外来调节这种胞内pH值的

铵离子环境下，为了维持胞内PH的稳定，需要一种额外的运输系统（高亲和性的钾离子吸收系统，Kdp）负责铵离子的吸收和质子的泵出。由此可知，细胞环境中铵离子和乙酸浓度的增加必然降低细胞

降低，因此扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。此

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answerbasicbiologicalquestions.

TheJournalof

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［3］Eiteman

MA，Altmancoli

Overcomingprotein

acetate

对能量的利用率。pta缺失株发酵过程中乙酸含量NH4+累积浓度降低了33.2%，降低了80.5%，减少了ATP的消耗，提高了能量利用率，菌体生物量显著提高。

Schuster［15］对L-色氨酸代谢网络优化结果表EMP途径和TCA循环代谢流量减少，PP途径明，

代谢流量增加，可为菌体提供充足的NADPH和L-色氨酸生物合成前体物，有望大大增加色氨酸合成的代谢流。但W3110A生产L-色氨酸代谢流结果PP途径代谢流增加，L-色氨酸代谢流并未增显示，

强。发酵过程中苯丙氨酸和酪氨酸对3-脱氧-α-阿7-磷酸合成酶的反馈抑制，拉伯庚酮糖-大大降低了DAHP合成酶的活性，使得大量碳流经r16（图4所Schuster还指出，磷酸示）回流至EMP途径。同时，

烯醇式丙酮酸（PEP）的过度消耗也是L-色氨酸代谢流减少的限制因素。本文E.coliTRTHΔpta是酪氨酸和苯丙氨酸缺陷株，对DAHP合成酶的反馈抑因此与Schuster设计的理想L-色氨酸制已经解除，

PEP生成代谢网络一致。PEP节点分析结果表明，PEP生成L-色氨丙酮酸的代谢流量减少了37.8%，酸的代谢流量增加了7.0%。

本文利用Red重组系统敲除大肠杆菌pta基因，并对pta缺失株的生长特性进行了初步研究。根据已有报导

［11］

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