clontech race primer

The SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒提供了一种执行包括5’和 3’ cDNA末端快速扩增的方法 (RACE)，这种试剂盒是改进版本，包括一种新的SMARTer II A低聚核苷酸SMARTScribe反转录，它提供了更好的敏感性,更少的背景材料和较高的特异性，这种强大的系统允许您从只有10ng总RNA中隔离你的完整的目标转录本的5’序列，The SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒的基础是一种智能技术，它在RACE PCR中排除了有问题的接头连接的需要，让你直接用第一条cDNA，使RACE更快更简便，另外SMARTer RACE试剂盒利用Clontech专利的抑制PCR和跨步PCR以提高RACE反应的敏感性降低背景材料。结果是您可以使用polyA+或总RNA作为构建甚至非常少的转录本的完整的cDNAs的开始材料。

SMART智能技术在反转录反应中提供了一种合成全长cDNAs机制。使得SMARTer II A低聚核苷酸和SMARTScribe反转录联合反应成为可能。这个SMARTScribe 反转录,一旦到达RNA模板的末端,就表现出末端转录的活性, 使第一股cDNA的3 '端增加3 – 5个残基(图1) 这个SMARTer低聚糖包含一个使延长的cDNA尾巴退火的修饰碱基的末端延伸，从而允许这个低聚糖作为反转录的模板，SMARTScribe反转录从mRNA分子到SMARTer低聚糖改变模板，产生一个的初始RNA的完整cDNA复制其末端有额外SMARTer序列。由于这种模板仅当酶到达RNA模板末端时改变反转录活性。这个SMARTer序列通常仅仅纳入到第一条全长cDNAs。该技术更多信息请阅读···。这个过程保证高质量的RNA的使用将使得一套有最大数量的5 '序列cDNAs的形成。

在反转录之后SMART技术允许第一条cDNA链在5 ' -3'RACE PCR反应中直接使用。第一条cDNA合成时在单步中通用引物结合位点的合并排除了冗长的第二条链的合成和接头连接的需要。这个简单的和高效的SMARTer cDNA合成方法在扩增你的目标cDNA时确保更高的特异性。抑制PCR及跨步PCR技术与SMARTer技术结合在RACE PCR扩增中降低背景材料。 SMARTer RACE cDNA扩增的唯一需要是要知道最少23-28个核苷酸序列信息，目的是为5 ' -3'RACE反应设计基因特异性引物。（额外的序列信息将会有助于你的RACE产品的分析）这有限的需要通过多种方法表征基因特征使得SMARTer RACE更加理想,方法包括cDNA敲除、差异显示，RNA的指纹图，est，文库筛查等。SMARTer RACE cDNA扩增是一个灵活的工具。许多研究人员使用这个试剂盒代替传统的试剂盒来扩增特意cDNA的仅5 '或 3 '端。其他人执行包括5 '和3'RACE中,然后使用后面协议的部分介绍了这个两种方法之一继续克隆全长cDNAs。在许多情况下,研究人员获得完整的cDNAs不用构建或筛选cDNA文库。

下面的表描述了生成RACE准备的cDNA、执行5 ' & 3 'RACE PCR反应, 和用SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒描绘最终RACE产品结果的必要步骤。请参阅执行每步细节的特别部分。RACE的详细机制参考附录A& B。 步骤 引物设计 描述 你必须为5 '和或3 'RACE PCR反应设计特异性引物（GSP1和GSP2分别地）据描述巢式引物有助于你的PCR产品的分析。如果必要的话它们可以为巢式RACE PCR使用。在第四部分会详细描述引物设检查RNA模板的质量 RACE准备的第一条cDNA链的合成 计。图表三显示用在SMARTer RACE反应中的引物与模板的关系。 RNA的纯度对cDNA的合成和SMARTer RACE成功是关键因素。最主要是对cDNA的合成，必须保证你的RNA是完整的无污染的。 自从SMART技术的好处是5 '伸长只与5 'RACE相关， SMARTer RACE试剂盒包括一个包括两个独立的cDNA群的合成协议的: 5 'RACE 准备cDNA和3 'RACE 准备cDNA。5 'RACE cDNA是利用一个修饰的锁定对接低聚（dT）引物和如前面所述的the SMARTer II A oligo。这 V.C 部分 IV 个修饰的低聚（dT）引物。称为5’-RACE CDS引物A（5’CDS）在3’端有两个退化的核苷酸位点。在多聚腺苷酸尾巴的起始点的引物的核苷酸位点，因此排除了3’异质性固有低聚（dT）启动。3’RACE是用传统的反转录方法合成的，但就是用一个特殊的低聚（dT）引物，这个3’-RACE CDS引物包括与5’CDS引物一样的锁定的核苷酸位点，在5’端也有一个SMARTer序列部分。通过将SMARTer序列整合到包括5’和3’RACE准备的cDNA群，你能用通用引物A Mix启动RACE PCR反应，它能识别SMARTer序列，结合独特的基因特异性引物。另外没有多聚腺苷酸RNA被使用附录D的协议随机引物启动。 正面控制的RACE实验 用你的模板执行RACE前，我们强烈推荐你使用试剂盒提供的控制 人类胚胎总RNA进行正面控制的RACE实验。 5’ & 3’ RACE 在你生成RACE准备cDNAs后你将会有足够的材料仅通过不同的特 PCR反应 异性引物执行不同的基因的5’和3’RACE，在SMARTer RACE协议的所有PCR反应被优化使用Advantage 2聚合酶混合物。其提供一个自动的热启动，确保你执行长距离的PCR反应，同时使你的产品对RACE产品的特征 原始序列有高的保真度，使你能扩增出长的模板。 在建立你的全长cDNA之前，我们强烈推荐你确认你要放大的目标 序列，你能通过以下一种或多种方法表征你的PCR产品，1.比较由GSP1 和 UPM与NGSP1 和 UPM产生的PCR产品2. 用一个内部基因特定探针探索一个Southern blot的PCR产物 (例如,标记NGSP1)3. 克隆和测序你的RACE的产品。一般来说,我们建议您获得至少部分序列信息。在你的后续实验中，小心表征RACE产品特征这一点上可以防止混乱和浪费精力,甚至当在两个RACE反应产生单一的主要产品。如果你有多个RACE产品或怀疑你正在使用基因家族的一员，这个分析是特别重要的。

引物设计

A． 引物序列

基因特异性引物（GSP）应该是 23-28nt 50-70%GC

Tm≥65°C; 如果Tm>70°C能得到最好的结果（确保降落PCR的使用） GSP与Universal Primer Mix的3’端无互补性

对你感兴趣的基因有特异性

用在SMARTer RACE反应的模板引物和产生的PCR产物在下图有详细介绍，完整的说明书中，你需要至少两个GSP：一个5’-RACE PCR的反义引物和一个3’-RACE PCR的正义引物，如果你只进行其中一个反应，那就只需要一个GSP，所有的引物应该是23-28nt，用大于30nt的效果反而不好，如图所示的引物产生了两个反应的重叠序列，如果一个合适的限制位点位于该地区的重叠区域，那么这些片段可以随后会参与限制消化和连接来创建完整的cDNA。通过设计引物在PCR产物中产生100-200bp的交叠片段，你也可以用一起这些引物为PCR产物作正面控制，然而产生重叠序列也并非完全必要。对于大的或和罕见的cDNA你使用接近cDNA末端的引物，可能会更好。因此也不能产生重复序列，另外引物本身也能重叠。

在我们的实验中，长的引物退火温度在70度以上扩增效果较好，特别是较差的样

本水平，Tm超过70允许你使用降落PCR,如果设计的GSP1和GSP2有相似的Tm将有利于该实验的进行，可通过跑梯度来确定其Tm，避免使用序列互补引物。 B.引物序列的定位

我们曾经已经利用该试剂盒通过GSP结合位点延伸至6.5kb,而且对于优化的结果，我们推荐你选择你的引物，这样你的产物是2kb或更少。 C.降落PCR

我们已经发现降落PCR能提高RACE的特异性，降落PCR在初始循环中退火温度高

于一般引物，如果你的GSP大于70度，仅有严格的特异性产物产生，然后的退火

温度降低到UPM相适应的水平。允许高效,指数放大的基因特定的模板。正如上面所提到的,我们建议使用引物Tm的大于 70°C,允许您使用降落PCR。 D.嵌套引物

我们建议你在开始实验时不使用嵌套PCR，用这个UPM引物和GSP通常可以生成好

的PCR产物，Southern 印记通过以嵌套GSP为探针描述你的RACE产品是有用的。

而且嵌套式pcr以单独GSP在太高的背景水平的或非特异性扩增的反应进行5 ' -或3”RACE

反应的情况下可能是必要的。在嵌套式PCR中，通过外引物执行主要的扩增，如果模糊产生，用其中一份PCR产物用内引物扩增，技术说明书中包括可选步骤表明嵌套式引物可以用，嵌套式一般引物A可以用于5和3’PCR(试剂盒提供)

嵌套的基因特异性引物要根据上面讨论的指导方针进行设计，如果可能的话，嵌套

的引物和外基因特异性引物不应该重叠，如果他们有有限的序列信息必须重叠，3 '端内引物应该有尽可能多独特的序列。