柚皮苷的提取方法及其应用研究进展

柚皮苷的提取方法及其应用研究进展

作者：于宏伟 谷维娜 李娜 张芳 刘晓芳 位会棉 来源：《湖北农业科学》2011年第08期

摘要：柚皮苷是一类重要的天然黄酮类化合物。综述了柚皮苷的提纯方法及其在医学、食品科学、化学等方面的应用研究进展。 关键词：柚皮苷；黄酮；提纯；应用

中图分类号：Ｓ６６６．３；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1516-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｎａｒｉｎｇｉｎ

ＹＵ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ，ＧＵ Ｗｅｉ－ｎａ，ＬＩ Ｎａ，ＺＨＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ｆａｎｇ，ＷＥＩ Ｈｕｉ－ｍｉａｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００３５，Ｈｅｂｅｉ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｎａｒｉｎｇｉｎ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ the ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ， ｆｏｏｄ ｓｃｉｅｎｃｅ， ａｎｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｅｒｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｎａｒｉｎｇｉｎ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

柚子是芸香科植物柚的成熟果实，产于我国福建、江西、广东、广西等南方地区。柚子清香、酸甜、凉润，营养丰富，药用价值很高，是人们喜食的名贵水果，也是医学界公认的最具食疗效益的水果之一。我国是世界产柚大国，根据联合国粮食及农业组织（ＦＡＯ）统计，２００８年我国产柚子约为５７万ｔ，且呈进一步快速增长态势。研究表明，柚皮中主要含有的

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

柚皮苷（Ｎａｒｉｎｇｉｎ，ＣＡＳ １０２３６－４７－２）是一类天然黄酮类（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ），主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其变种的果皮中［１，２］。柚皮苷被广泛应用于医学、食品科学、化学等方面。在世界资源日益枯竭的形势下，柚皮苷这一可再生资源如果不进行加工利用，实在是一种巨大的浪费，本文主要综述了从柚子的皮、种子及其废弃物中提取柚皮苷及其应用研究的最新进展。 １柚皮苷的提取方法

柚皮苷的提取方法主要包括：溶剂萃取法、碱提酸沉法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等。

１．１溶剂萃取法

溶剂萃取法主要是利用柚皮苷在有机溶剂（甲醇或乙醇）中溶解度较大的原理，直接从柚皮中萃取橙皮苷。广西医科大学时雪峰［３］选择６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇作为提取溶剂、在料液比1∶２０、提取温度９０℃ 条件下，保温浸提２ ｈ后，采取柱层析（聚酰胺为填充剂；蒸馏水、９５％乙醇作为洗脱液）的方法，从柚皮中分离柚皮苷粗产品，提取率为２．３６％（重结晶后纯度为７６％）。四川大学贾东英等［４］则对上述工艺加以改进，选择７０％（V/V）乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶２５、提取温度６０℃条件下，保温浸提１ ｈ后，柚皮苷的提取率为６．７５％（重结晶后纯度为９０％）。溶剂萃取法提取柚皮苷不仅可使柚皮苷得到有效的提取和分离，而且对柚皮的其他活性成分无破坏作用，其残渣还可用于果胶或纤维素等生理活性成分的制备，或直接作为人类膳食纤维的来源应用于食品加工，因而更有利于资源的综合利用。 １．２碱提酸沉法

碱提酸沉法主要是利用柚皮苷在碱性条件下开环溶解，在酸性条件下闭环析出的原理，从柚皮中提取柚皮苷。四川理工学院游见明等［５］采用碱提酸沉法从柚实果皮中提取柚皮苷。试验结果表明：用饱和Ｃａ（ＯＨ）２溶液作溶剂、料液比1∶１０、温度６０ ℃、提取时间３ ｈ的条件下，柚皮苷的提取率为 ０．８４％。宜春学院闻永举等［６］则对上述工艺进行优化，采用1％（Ｖ／Ｖ）Ｃａ（ＯＨ）２溶液作溶剂、料液比

1∶８、提取温度８０℃、提取３次（每次３０ ｍｉｎ）工艺条件，柚皮苷的提取率为２６％。该工艺方法简单、成本低、重复性好，能够用于工业化生产。 １．３二氧化碳超临界萃取法

二氧化碳超临界萃取技术的原理是利用超临界二氧化碳对某些天然产物具有的特殊溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来，然后借助减压、升温的方法

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的［７，８］。美国学者ＹＵ等［８］采用二氧化碳超临界萃取技术从柚子种子中提取柚皮苷，在 ４１．１ ＭＰａ的压力下、５０℃的提取温度、２０％的乙醇浓度、流动相保持５．０ Ｌ／ｍｉｎ的条件下、４０ ｍｉｎ内，柚皮苷最高收率可达到０．２ ｍｇ／ｇ（种子）。 １．４微波辅助提取法

微波辅助提取法是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的一种新的萃取方法。在微波提取中，微波利用其穿透性能够透入基质内部，被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，使胞内温度迅速升高，连续高温使其内部压力超过细胞空间膨胀的能力，导致细胞破裂，胞内有效成分自由流出，传递到周围被溶解。另外，微波所产生的电磁场加速了被萃取组分由物料内部趋向萃取溶剂界面的扩散速度，缩短了扩散时间，从而大幅度提高萃取速率，同时也降低了萃取时间，最大限度保证萃取的质量［９，１０］。北京化工大学王桂花等［９］选择 ４０％（Ｖ／Ｖ）乙醇为提取溶剂，从枳壳中提取柚皮苷。在微波功率４２５ Ｗ，液固比为５０ ｍＬ／ｇ，萃取时间４ ｍｉｎ的最佳条件下，提取率为４．１％。湖南农业大学苏东林［１０］则采取以蒸馏水为溶剂，提取柑橘皮中的黄酮（主要是橙皮苷和柚皮苷）。其中在微波功率为４００ Ｗ、萃取时间３ ｍｉｎ、液料比５０∶１、ｐＨ值５的条件下，所得黄酮总含量为３．３７％。研究表明，微波提取法具有萃取时间短、溶剂用量少、提取率高、产品品质好等诸多优点。 １．５超声波辅助提取法

超声波辅助提取技术是一种新的提取分离技术。它主要是利用超声波的非热作用－机械作用、空化作用和传统的溶剂萃取法或碱提酸沉法相结合的原理。超声波在介质传播过程中引起介质质点加速度增大，这也就加大了溶剂进入提取物细胞的渗透性，从而强化了提取过程。而当空化作用产生时，在固／液非均相体系的接口发生气泡爆破，破坏了植物的细胞壁，再加上碰撞次数增多、物质交换次数也就增多，细胞膜的透过能力得到增强，使萃取效率提高［１１－１３］。浙江大学刘英等［１１］采用超声波辅助提取法从四季柚中提取柚皮苷。在提取时间为１ ｈ时、提取温度５０ ℃、固液比１∶３０、５０％乙醇、提取功率２５ Ｗ的条件下，柚皮苷提取率为５．４４％。浙江大学马亚琴等［１２］采用８０％（Ｖ／Ｖ）甲醇作为萃取溶剂从珀溪蜜柚果皮中提取柚皮苷。在超声时间３０ ｍｉｎ，固液比１∶２０，超声温度４０ ℃，超声功率８ Ｗ的条件下，柚皮苷的提取率约为５．００％。湖南大学周强［１３］开发了从柚皮中提取柚皮苷的新工艺，即在传统的碱提酸沉方法基础上，引入超声提取技术来强化萃取效果。优选得最佳工艺条件：超声温度２５ ℃、超声时间３０ ｍｉｎ、饱和Ｃａ（ＯＨ）２溶液与柚皮质量比４∶１、超声频率２５ ＫＨｚ。按此优选最佳工艺试验３次，精制柚皮苷平均收率可达到１．８２％（为常规浸提法的１．５８ 倍）。

２柚皮苷的应用

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

２．１柚皮苷在医学中的应用

柚皮苷显示出多种生物学活性和药理作用。广州中医药大学苏玲等［１４］报道柚皮苷具有降低胆固醇的作用，主要是通过抑制体内参与胆固醇合成酶的活性，减少胆固醇在体内的合成，促进胆固醇的分解，减少体内低密度脂蛋白等途径实现的。柳州两面针股份有限公司覃青云等［１５］把柚皮苷添加到牙膏中。药理试验结果表明，含有天然植物活性成分柚皮苷的新型牙膏具有较好的消炎、止血作用，急性毒性试验也表明柚皮苷是安全的。同时柚皮苷在牙膏中的稳定性研究表明，柚皮苷作为功效成分加入牙膏中质量是稳定可控的。此外柚皮苷还被广泛应用在血液［１６，１７］、骨细胞［１８］、肌肉细胞［１９］等医学研究领域中。 ２．２柚皮苷在食品科学中的应用

柚皮苷可作为天然抗氧化剂广泛应用于食品科学中。长沙理工大学李赤翔等［２０］选择柚皮苷作为猪肉的天然抗氧化剂。研究发现：柚皮苷则有很明显的改善肉的亮度和黄度的作用，对肉红度的影响先是降低再回升。综合考虑球蛋白沉淀反应和新鲜度感官指标，应该选择５ ｇ／ｋｇ的柚皮苷作为猪肉等动物肉的天然抗氧化剂和防腐保鲜剂，效果比较显著。但通常柚皮苷具有一定的亲水性，这就影响了其作为天然抗氧化剂的使用效果。希腊Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｔｈｅｎｓ学者Ｋｏｎｔｏｇｉａｎｎｉ［２１］则对柚皮苷进行改性，通过脂肪酶催化酯化反应，在其分子中引入脂肪链，大大降低其亲水性。四川大学贾冬英等［２２］制备出柚皮苷－铁配合物，其抗氧化作用最大，有望作为一种新型抗氧化剂应用于油脂中，也可作为一种功能性食品基料，用于特殊功能性食品的生产，使人体在摄入抗氧化剂的同时，也得到微量元素铁的补充。 ２．３柚皮苷在化学中的应用

柚皮苷还作为一种重要的原料广泛应用在化学合成中。分子印迹膜由于兼具分子特异识别和膜分离的双重优点，自２０世纪９０年代初开始受到越来越多的关注［２３，２４］。福建师范大学黄丽梅等［２３］，以柚皮苷为模板分子，壳聚糖为膜材料，通过硫酸交联在水相中制备了水相识别柚皮苷分子印迹壳聚糖膜。此外柚皮苷［２５－２８］还可以水解成柚（苷）配基－７－Ｏ－葡糖苷（Nａｒｉｎｇｅｎｉｎ－７－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、柚皮素（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、鼠李糖（Ｌ－ｒｈａｍｎｏｓｅ）、葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）等重要生物医药化工中间体。 ３结论

柚皮苷广泛应用在医学、食品科学、化学等领域。但是，国内关于柚皮苷的应用研究却鲜见报道。而我国是一个柚子生产大国，具有丰富的柚皮苷资源，因此大力开发利用柚皮苷，前景广阔。 参考文献：

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

［１］ ＭＩＴＣＨＥＬＬ Ｄ Ｈ，ＰＥＡＲＣＥ Ｒ Ｍ，ＳＭＩＴＨ Ｃ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｂｉｔｔｅｒ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｌｉｍｏｎｉｎ ｆｒｏｍ ｃｉｔｒｕｓ ｊｕｉｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ［Ｐ］． ＵＳＡ，４５１４４２７，１９８５．

［２］ ＴＳＥＮ Ｈ Ｙ． Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ． ｎａｒｉｎｇｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｌｉｍｏｎｉｎ ｆｒｏｍ ｆｒｕｉｔ ｊｕｉｃｅ［Ｐ］． ＵＳＡ，４９７１８１２，１９９０．

［３］ 时雪峰． 柚皮苷提取纯化及其降血糖活性研究［Ｄ］． 南宁：广西医科大学．２００８．

［４］ 贾东英，姚开，谭敏，等． 柚皮中柚皮苷的乙醇提取工艺研究［Ｊ］． 中草药，２００２，３３（９）：８０１－８０２．

［５］ 游见明，兰江涛． 柑橘类柚皮苷提取工艺研究［Ｊ］． 现代食品科技，２００６，２２（２）：１６０－１６１．

［６］ 闻永举，申秀丽，易艳萍． 柚皮中柚皮苷提取工艺研究［Ｊ］． 江苏农业科学，２００８（４）：２５７－２５８．

［７］ ＧＩＡＮＮＵＺＺＯ Ａ Ｎ，ＢＯＧＧＥＴＴＩ Ｈ Ｊ，ＮＡＺＡＲＥＮＯ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｅｌ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２００３，１４（４）：２２１－２２３． ［８］ ＹＵ Ｊ，ＤＡＮＤＥＫＡＲ Ｄ Ｖ，ＴＯＬＥＤＯ Ｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｆｒｏｍ ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ（ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ ｍａｃｆ）ｓｅｅｄｓ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，１０５：１０２６－１０３１．

［９］ 王桂花，周峰，赵常青，等． 微波辅助萃取枳壳中有效成分柚皮苷的研究［Ｊ］． 时珍国医国药，２００９，２０（１１）：２７１２－２７１３．

［１０］ 苏东林． 柑桔皮中黄酮类物质的提取、分离及纯化研究［Ｄ］． 长沙：湖南农业大学． ２００７．

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

［１１］ 刘英，但俊峰，吴丹，等． 柚皮中柚皮苷的超声波辅助提取条件研究［Ｊ］． 西北农林科技大学学报（自然科学版），２００８，３６（４）：２１８－２２２．

［１２］ 马亚琴，陈健初，江萍，等． 超声辅助提取珀溪蜜柚皮重酚酸的研究［Ｊ］． 食品与发酵工业，２００８，３４（７）：１５９－１６３．

［１３］ 周强．柚皮与柚籽中果胶、柚皮苷和类柠檬苦素的提取研究［Ｄ］． 长沙：湖南大学．２００７．

［１４］ 苏玲，刘启德． 柚皮苷生物活性和药代动力学研究新进展［Ｊ］． 中国医药技术经济与管理，２００８，２（１０）：７４－８０．

［１５］ 覃青云，卢凯玲，许静，等． 柚皮苷在口腔护理用品中的应用研究［Ｊ］． 牙膏工业，２００９，１９（２）：２５－２９．

［１６］ ＺＨＡＮＧ Ｙ Ｈ，ＬＩ Ｙ，ＤＯＮＧ Ｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２００８，８７５：１－８．

［１７］ ＪＡＧＥＴＩＡ Ｇ Ｃ，ＲＥＤＤＹ Ｔ Ｋ，ＶＥＮＫＡＴＥＳＨＡ Ｖ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｏｎ ｆｅｒｒｉｃ ｉｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］． Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，２００４，３４７：１８９－１９７．

［１８］ ＷＯＮＧ Ｒ Ｋ，ＲＡＢＩＥ Ａ Ｂ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｒａｆｔ ｏｎ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６，２７：１８２４－１８３１．

［１９］ ＫＩＭ Ｓ Ｈ，ＺＯ Ｊ Ｈ，ＫＩＭ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｎａｒｉｎｇｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｏｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２３：１６７１－１６８３．

［２０］ 李赤翔，俞建，曾亮，等． 柚皮苷对猪肉的抗氧化作用的研究［Ｊ］． 食品研究与开发，２００８，２９（１０）：２０－２３．

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

［２１］ ＫＯＮＴＯＧＩＡＮＮＩ Ａ，ＳＫＯＵＲＩＤＯＵ Ｖ，ＳＥＲＥＴＩ Ｖ，ｅｔ ａｌ． Ｌｉｐａｓｅ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｗｉｔｈ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎ ｃｈａｉｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００３，２１：５９－６２．

［２２］ 贾冬英，姚开，何强，等． 柚皮苷－金属配合物的抗氧化活性研究［Ｊ］． 中国油脂，２００５，３０（４）：３０－３３．

［２３］ 黄丽梅，马秀玲． 分子印迹壳聚糖膜和柚皮苷模板分子间相互作用的研究［Ｊ］． 广州化学，２００９，３４（１）：２７－３１．

［２４］ ＴＲＯＴＴＡ Ｆ，ＤＲＩＯＬＩ Ｅ，ＢＡＧＧＩＡＮＩ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００２，２０１：７７－８４． ［２５］ 刘亚萍． 柚皮素的制备方法研究［Ｊ］． 光谱实验室，２００８，２５（６）：１２９２－１２９４．

［２６］ ＫＲＡＴＫＹ Ｚ，ＴＡＮＤＹ Ｊ Ｓ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ［Ｐ］． ＵＳＡ，５００８３８１，１９９１．

［２７］ ＲＩＢＥＩＲＯ Ｉ Ａ， ＲＯＣＨＡ Ｊ， ＳＥＰＯＤＥＳ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｏｔｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，２００８，５２－５３：１３－１８． ［２８］ ＰＵＲＩ Ｍ，ＫＡＵＲ Ａ，ＳＩＮＧＨ Ｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓ－ｔａｇｇｅｄ ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，４５：４５１－４５６．