异烟肼人体血药浓度测定及药代动力学研究

曾德贵;刘玉琴

【摘 要】Objective To establish an RP- HPLC method for determination of the concentrations of isoniazid in healthy volunteers and to study its pharmacokinetics. Methods The samples were analyzed on YWG-Ci8 colunm, the mobile phase was eluted with 0.02 mol/L KH2PO4-

CH3OH(61:39), and detection wavelength was 340 nm, the sample size was 20 μL. Results The concentration of isoniazid showed good linearity in the range of 0. 2- 12.0 mg/L( r=0. 999 6). The relative standard deviation of intra-day and inter-day were both less than 4.0％. The average recovery rate of isoniazid was 97.67％, RSD was 2. 31％ (n = 9). Conclusion The RP- HPLC method was suitable for the pharmacokinetic study of isoniazid and monitoring its concentration for the clinical application.%目的 建立测定人血浆中异烟肼质量浓度的反相高效液相色谱法并研究异烟肼的药代动力学.方法 采用YWG-C18色谱柱(200mm×4.6 mm,5 μm),以0.02 mol/L磷酸二氢钾-甲醇(61:39)为流动相,检测波长为340 nm,进样量20 μL.结果 异烟肼的血浆质量浓度在0.2～12.0 mg/L范围内与峰面积线性关系良好(r=0.9996);日内、日间精密度RSD均小于4.0%;平均回收率为97.67%,RSD=2.31%(n=9).结论 反相高效液相色谱法适用于异烟肼药代动力学研究和-临床血药浓度监测. 【期刊名称】《中国药业》 【年(卷),期】2011(020)003 【总页数】2页(P6-7)

【关键词】异烟肼;药代动力学;反相高效液相色谱法;血药浓度 【作 者】曾德贵;刘玉琴

【作者单位】广东省深圳市慢性病防治中心,广东,深圳,518020;北京大学深圳医院,广东,深圳,518048 【正文语种】中 文

【中图分类】R969.2;R927.2;R978.3

抗结核病药异烟肼在临床应用中可引起约20%的肺结核病患者出现肝功能变化。异烟肼进入人体后经酰胺酶催化，直接或间接生成肼(hydrazine)，肼可引起肝脏出现甘油三酯积聚、三磷酸腺苷(ATP)耗竭等毒性反应，是异烟肼致肝损伤的重要毒性代谢产物。结核杆菌对异烟肼极易产生耐药性，并且随着用药时间的延长，异烟肼血药浓度持续升高，易致结核病患者出现严重肝损伤，因此应在使用过程中进行血药浓度监测[1－2]。目前，测定异烟肼血药浓度有许多方法[3－5]，但大都存在提取率低、操作烦琐的问题。笔者对以前的方法作了综合改进，将异烟肼进行柱前衍生化，降低其极性，增强其紫外吸收，旨在建立一种灵敏度高、特异性好的反相高效液相色谱法以测定血浆中异烟肼的质量浓度。 1 仪器与试药

LC－1型高效液相色谱仪(日本岛津);TGL－16G型台式高速离心机。异烟肼标准品(美国Sigma公司，批号为22409231);异烟肼片(沈阳红旗制药有限公司，规格为100 mg/片，批号为080615);香草醛、三氯醋酸、三乙胺、磷酸二氢钾、甲醇均为国产分析纯。 2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:YWG－C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);预柱:YWG－C18柱(25 mm ×6 mm，5 μm);流动相:V(0.02 mol/L KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39，每 500 mL流动相加入 70%(V/V)的 HClO4 0.2 mL 及 20%(V/V)的三乙胺 0.4 mL;检测波长:340 nm;流速:1 mL/min;进样量:20 μL。在此色谱条件下，色谱峰峰形好、分离完全，血浆中内源性物质不干扰异烟肼的测定，异烟肼衍生物保留时间为11.08 min，香草醛保留时间为8.46 min，全程测定时间约13 min，色谱见图1。 图1 高效液相色谱图 2.2 标准溶液配制

准确称量异烟肼标准品10.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得含异烟肼1 000 mg/L的标准贮备液。移取标准贮备液5.0 mL，稀释至10 mL，配制成500 mg/L的异烟肼标准溶液备用。 2.3 血浆样品采集与预处理

抽取健康人静脉血，经高速(3 000 r/min)离心处理10 min后，吸取血浆，于－20℃下冷冻保存，作为空白血浆样品备用。健康受试者单剂量口服异烟肼片300 mg后，在24 h内分12个时间段分别抽取静脉血5.0 mL，高速(3 000 r/min)离心10 min分离血浆，吸取血浆，于－20℃下冷冻保存，作为异烟肼血浆样本待测。取血浆样品0.25 mL，置1 mL离心试管中，加100 g/L的三氯醋酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，然后加甲醇至总体积为0.5 mL。将上述溶液置40℃水浴反应20 min，冷却，高速(1 000 r/min)离心5 min，吸取上清液20 μL进样，按外标法定量。 2.4 方法学考察

标准曲线建立:取空白血浆0.25 mL共6份，分别加入质量浓度为 500 mg/L 的异烟肼标准溶液 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 μL，再分别加入100 g/L的三氯醋

酸50 μL和16 g/L的香草醛溶液40 μL，加甲醇至 0.5 mL，制成质量浓度分别为 0.2，0.8，2.0，4.0，8.0，12.0 mg/L的溶液。异烟肼血浆样本经预处理后，分别进样20 μL，测出其峰面积。将峰面积(Y)对血浆样品的质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程 Y=2.93×105X－9.30×104，r=0.999 6(n=6)。结果表明，异烟肼质量浓度在0.2～12.0 mg/L范围内与峰面积线性关系良好，最低定量浓度为0.2 g/L。

精密度试验:按标准溶液配制方法精密配制异烟肼低、中、高3种质量浓度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的溶液，依法进样，连续测定 5 d，由测得质量浓度计算日间精密度，并于标准曲线建立的同天测定日内精密度。结果日内精密度 RSD分别为 2.6%，2.5%，2.4%(n=6);日间精密度 RSD 分别为 3.9% ，3.7% ，4.0%(n=5)。所得 RSD均在4.0%以内，表明精密度符合要求，测定方法可靠。

稳定性试验:将含异烟肼的血浆样品置－20℃低温冰箱冷冻保存，30 d后测定含量。结果高、中、低3种质量浓度的样品含量分别为 97.56%，99.28%，98.75% ，RSD 均在 3%以内，表明异烟肼的血浆样品在－20℃低温保存条件下至少30 d内含量保持稳定。

回收率试验:依法操作，制备异烟肼低、中、高3种质量浓度(0.8，4.0，12.0 mg/L)的血浆样品，按样品预处理方法处理后，依法进样测定质量浓度，计算回收率。结果见表1。

表1 异烟肼的回收率试验结果(n=9)0.8 0.8 0.8 4.0 4.0 4.0 12.0 12.0 12.0 0.76 0.80 0.81 3.82 3.90 3.83 11.52 11.82 11.94 95.00 100.00 101.25 95.50 97.50 95.75 96.00 98.50 99.50 97.672.31 2.5 异烟肼血浆浓度测定

10例男性健康受试者单剂量口服异烟肼片剂300 mg，分别在服药前及服药后的 0，0.33，0.67，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.00，9.00，12.00，24.00 h

经前臂静脉取血 3 ～5 mL，立即置涂有肝素的离心管中，在避光处静置10～20 min，以5 000 r/min转速离心处理10 min，分离血浆，于－20℃冰箱保存待测。受试者给药后避免剧烈运动，试验期间禁烟、酒和含咖啡因的饮料。测定过程中，每日建立一条标准曲线，同时配制高、中、低3种质量浓度的质量控制样本，每一质量浓度做双样本分析，以判断当日结果的可靠性。按血浆样品预处理方法处理并测定，10例受试者的平均血药浓度－时间曲线见图2。 图2 10例受试者用药后血浆平均药物浓度－时间曲线 2.6 药代动力学参数

将测得的浓度取均数，作为主数据通过3P97程序拟合，计算药代动力学参数，达峰时间(tmax)和峰浓度(Cmax)采用实测值，用梯形法计算0～t药－时曲线下面积(AUC0－t)和0－∞药－时曲线下面积(AUC0－∞)，以半对数作图法，由消除相末端浓度点计算半衰期(t1/2)。主要药代动力学参数见表2。 表2 异烟肼的药代动力学参数(± s，n=10) 3 讨论

异烟肼有快代谢型和慢代谢型，因此建立快捷、高灵敏度的异烟肼血药浓度监测方法很有意义。异烟肼极性大，在血浆中浓度低，所以在文献[6]的基础上采用异烟肼与香草醛的柱前衍生化反应，生成弱极性化合物异烟肼－香草醛腙，使异烟肼极性降低，易溶于有机溶剂，紫外吸收增强，提高了检测灵敏度和专属性。采用V(KH2PO4)∶V(CH3OH)=61∶39的流动相时，色谱峰峰形好、分离完全。另外，结核病患者往往同时服用利福平、吡嗪酰胺等几种抗结核病药，因而测试易受血浆中杂质和其他抗结核病药的干扰。因此，还对利福平、吡嗪酰胺两药进行了干扰测试，在上述色谱条件下，利福平、吡嗪酰胺在340 nm波长处无吸收，对本方法无干扰。本研究为异烟肼的血药浓度监测提供了一种灵敏、准确、方便的实验方法。 参考文献:

[1]Dahl ML，Sjoqvist F.Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic monitoring ofantidipressantsand neuroleptics[J].TherDrug Monit，2000，22(1):114.

[2]Lennard L.Therapeutic drug monitoring of antimetabolic cytotoxic drugs[J].Br J Clin Pharmacol，1999，47(2):131.

[3]许赤鸣，陈 冰，王 洁，等.高效液相色谱法测定人血浆中异烟肼及乙酰异烟肼浓度[J].中国药房，2005，16(13):1 001－1 002.

[4]黎昌权.高效液相色谱法测定异烟肼注射液的含量[J].中国药业，2008，17(8):32－33.

[5]乐 江，彭仁琇，刘 娟.RP－HPLC法测定血浆中异烟肼代谢物的含量[J].中国药科大学学报，2004，35(1):47－49.

[6]雷 勇，卓海通.用柱前衍生化法测定异福酰胺片中异烟肼的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2000，20(4):208.