外周血造血干细胞动员后采集时机的快速动态监测

维普资讯 http://www.cqvip.com 江西医学院学报２００７年第４７卷第２期　Ａｃｔａ　Ａｃａｄｅｍｉａｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ　Ｊｉａｎｇｘｉ　２００　７　！！　ｏ２　・８１・　外周血造血干细胞动员后　采集时机的快速动态监测　蒋铁斌，李昕，易萌清，刘竞，钟竹青　（中南大学湘雅三医院血液科，长沙４１００１３）　摘要：目的探讨一种简单、快速判断外周血造血干／祖细胞最佳采集时机的方法。方法　利用Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ　２０００Ｉ多通道血细胞分析仪的ＶＣＳ和化学染色技术，对９例异基因外周血造血干细胞（Ａｌｌｏ—ＰＢＳＣＴ）的健康供者和　５例自体外周血造血干细胞（ａｕｔｏ—ＰＢＳＣＴ）患者，在动员过程中采集外周血进行外周血循环幼稚细胞（ＰＢＣＩＣ）检测。　同时应用流式细胞术（ＦＣＭ）和集落培养法分别对上述外周血中的ＣＤ３４　细胞、粒一巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ—　ＧＭ）进行检测，观察三者之间的相关性。结果ＰＢＣＩＣ与ＣＤ３４　细胞及ＣＦＵ—ＧＭ呈良好的正相关，相关系数分　别为０．７８９和０．８７７。健康供者干细胞动员后ＰＢＣＩＣ的峰值出现于使用Ｇ－ＣＳＦ后的第５～６天，ＰＢＣＩＣ的变化幅　度较ＣＤ３４　和ＣＦＵ—ＧＭ的变化幅度大。结论　利用Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ　２０００Ｉ多通道血细胞分析仪检测ＰＢＣＩＣ数能快速　简便地监测外周血造血干／祖细胞的变化，为判断最佳采集时机提供了一种快捷简便的参考方法。　关键词：血细胞分析仪；外周血循环幼稚细胞；流式细胞术；集落培养　中图分类号：Ｒ７３—３５２　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００－－２２９４（２００７）０２－－００８１－－０３　外周血造血干细胞移植（ＰＢＳＣＴ）正在临床广　Ｆｇ／（ｋｇ・ｄ），皮下连续注射５～６　ｄ进行造血干细胞　泛应用，快速可靠重建造血对ＰＢＳＣＴ十分重要。　动员。粒细胞集落刺激因子动员的第４、５天开始采　而迅速的造血重建依赖于移植足够数量的造血干／　集，按照患者体重换算采集物总的单个核细胞数　祖细胞，但造血干／祖细胞在动员后的外周血中呈一　（ＭＮＣ），采集量为６～８×１０。／ｋｇ，采集１～２次。自　过性的增加，最佳采集时间短，因此动态监测动员后　体外周血造血干细胞移植患者行常规联合化疗后至　的外周血干／祖细胞，准确把握最佳采集时间是保障　白细胞最低时开始，给予Ｇ—ＣＳＦ　５　Ｆｇ／（ｋｇ・ｄ）动员　动员和采集质量的关键。作者利用Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ　造血干细胞，于外周血白细胞达到５×１Ｏ。／Ｌ时，开　２０００Ｉ多通道血细胞分析仪、流式细胞术和集落培　始外周血干细胞采集，采集目标为ＭＮＣ（４～６）×　养方法，比较了干细胞监测相关参数：外周血循环幼　１０。／ｋｇ。采集过程使用连续流动式Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｃｏｂｅ血　稚细胞（ＰＢＣＩＣ）ｌ＿１］、ＣＤ３４　细胞计数和粒一巨噬细胞　细胞分离机，采用Ａｕｔｏ　ＰＢＳＣ采集程序和一次性双　集落形成单位（ＣＦＵ—ＧＭ）计数在监测外周血干细　针分离管道。循环量为９　０００　１２　０００　ｍＬ。　胞采集时机中的作用。　１．３标本的采集　ｌ材料与方法　异基因外周血造血干细胞移植健康供者及自体　外周血造血干细胞移植患者每次注射Ｇ—ＣＳＦ后２　ｈ　１．１研究对象　抽取外周血２　ｍＬ，ＥＤＴＡ—Ｋ　抗凝血在Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ　共１４例，其中异基因外周血造血干细胞移植　２０００Ｉ多通道全自动血细胞分析仪进行ＰＢＣＩＣ检　（ａｌｌｏ—ＰＢＳＣＴ）的健康供者９例，男８例，女１例；自　测，流式细胞仪行ＣＤ３４　细胞检测。　体外周血造血干细胞移植（ａｕｔｏ—ＰＢＳＣＴ）患者５例，　异基因外周血造血干细胞移植健康供者及自体　分别是急性白血病２例（均为急性非淋巴细胞白血　外周血造血干细胞移植患者抽取外周血５　ｍＬ，肝素　病，移植前行５～６疗程化疗，方案为ＤＡ），淋巴瘤２　（５０　Ｕ／ｍＬ）抗凝，行ＣＦＵ—ＧＭ集落培养。　例（均为非霍奇金淋巴瘤，化疗方案为ＣＨＯＰ），骨　１．４方法　外尤文氏肉瘤１例（化疗方案为ＶＡＣ）。　１）ＰＢＣＩＣ检测：将采集的ＥＤＴＡ抗凝血直接　１．２外周血干细胞动员及采集方法　上机，利用Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ　２０００Ｉ全自动血细胞分析仪　健康供者用粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）５　检测出外周血循环幼稚细胞的百分比（ＰＢＣＩＣ　）及　收稿日期：２００６—１１—２９　维普资讯 http://www.cqvip.com ・８２・　江西医学院学报２００７年第４７卷第２期　ＡｃｔａＡｃａｄｅｍｉａｅ　Ｍ　ｉｃ　，ｌ　ｆｎ　ｇｘｉ—２００７，Ｖｏ—ｌ　４７，Ｎｏ２　绝对值（ＰＢＣＩＣ）。　２）　ＣＤ３４　细胞测定：ＣＤ３４　细胞测定用美国　＾１／Ｉｏ爱一ｕＨｕⅡｄ　ＣＤ３４　细胞和ＣＦＵ—ＧＭ于第３天开始出现升高，第　４天明显升高，第５天达到高峰，第６天仍高。动员　∞　∞伽　舢　∞　舢　　姗后健康供者ＣＤ３４　细胞计数最高升高达到５～８　倍，ＣＦＵ—ＧＭ平均升高约８～１Ｏ倍，而ＰＢＣＩＣ的升　高平均约２Ｏ倍。提示ＰＢＣＩＣ的上升幅度较　ＣＤ３４　细胞和ＣＦＵ—ＧＭ上升幅度要大。　ＢＤ公司ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪，ＰｒｏＣＯＵＮＴ方　案测定，试剂盒购自ＢＤ公司。　３）ＣＦＵ—ＧＭ计数：２．７　羟甲基纤维素，１２．５　ｇ／ｍＬ人重组粒单细胞集落刺激因子，３Ｏ　ＲＰＭＩ一　１６４０，加入ＭＮＣ的浓度为１０　／ｍＬ，置３７℃，５　ＣＯ　，饱和湿度条件下培养１４　ｄ。在倒置显微镜下　２）　动员后ＰＢＣＩＣ和ＣＦＵ－ＧＭ集落数呈非正　态分布。ＰＢＣＩＣ与ＣＦＵ—ＧＭ集落产率之间、ＰＢ—　观察每个集落，至少４Ｏ个细胞以上判定为ＣＦＵ—　ＧＭ集落。　１．５统计学处理　用ＳＰＳＳ１０．０统计软件进行统计学处理，计量　资料采用　＿－４－Ｓ表示，两组比较用ｔ检验。ＰＢＣＩＣ、　ＣＤ３４　细胞和ＣＦＵ—ＧＭ结果采用单因素方差分　析。直线相关分析采用Ｐｅａｒｓｏｎ检验。　２　结果　１）健康异基因外周血干细胞移植供者应用　Ｇ－ＣＳＦ动员后，ＷＢＣ在动员后的次日开始升高，第　３、４天明显升高，峰值出现于使用后的第５、６天。　健康供者与患者两组白细胞数有显著性差异（Ｐ＜　０．０５，ｔ一７．７００）　供者组高于患者组。ＰＢＣＩＣ、　ｎ　００　ｌ０．００　２０．００　３ｏ．００柏．００　５０．Ｄ０∞．Ｄ０　ａ　口Ｉ　×ｌＤ５个细膻）　图１动员后ＰＢＣＩＣ与ＣＦＵ—ＧＭ的相关性　图３高倍镜下ＣＦＵ—ＧＭ集落形态（ｘ　４００倍）　ＣＩＣ与ＣＤ３４　细胞之间存在良好的直线相关性。　其相关系数分别是０．８７７（Ｐ％Ｏ．０５）和０．７８９（Ｐ＜　０．０５）。健康供者组ＰＢＣＩＣ值高于患者组（Ｐ＜　０．０５，￡一３．１２８）。健康供者与患者ＣＦＵ—ＧＭ产率　比较存在显著性差异（Ｐ％Ｏ．０５，ｔ一３．１４２），健康供　者组高于患者组。　表１　动员后外周血中的ＷＢＣ、ＣＦＵ－ＧＭ集落、　ＰＢＣＩＣ、ＣＤ３４　计数（　士Ｓ）　印３４　（ⅪＯ　Ｄ　图２动员后ＰＢＣＩＣ与ＣＤ３４　的相关性　图４低倍镜下ＣＦＵ—ＧＭ集落形态（ｘ１００倍）　维普资讯 http://www.cqvip.com 江西医学院学报２００７年第４７卷第２期　Ａｃｔａ　Ａｃａｄｅｍｉａｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｅ　Ｊｉａｎｇ　２００７，Ｖ０ｌ４７，　０２　・８３・　３讨论　本文观察到健康供者在单用Ｇ—ＣＳＦ　５　ｕｇ／　（ｋｇ・ｄ）动员后，外周血中循环幼稚细胞（ＰＢＣＩＣ）的　流式细胞术和集落培养法，技术、仪器要求高。Ｓｙｓ一　１ＴＩｅＸ　ＸＴ２０００Ｉ检测ＰＢＣＩＣ能及时反映外周血造血　干／祖细胞的动态变化，对判断最佳采集时机提供准　确的信息，而且操作时样本无需特殊处理，样本测定　费时少，与ＣＤ３４　细胞计数和ＣＦＵ—ＧＭ计数相比，　峰值出现于使用Ｇ—ＣＳＦ后的第５～６天，与文献报　道的健康供者的动员规律一致＿２］。而患者在使用有　化疗的动员方案后，外周血中循环幼稚细胞（ＰＢ—　ＣＩＣ）的增殖过程差异大＿３］，分析其原因可能是由于　不同的患者原发病情况、以及既往治疗情况、干细胞　具有快速、简便、经济的优点，是一种高效、简单判断　外周血造血干细胞动员后最佳采集时机的好方法。　参考文献：　动员方案及并发症等不同，患者骨髓造血功能的情　况不同，因此难以有相对固定的造血干／祖细胞富集　过程。　在外周血造血干／祖细胞采集中，ＣＤ３４　细胞　的检测已经作为外周血造血干／祖细胞最佳采集时　机的判断和采集量预测的主要及首选方法［４　］。但　其需要的设备昂贵，标本需要特殊处理，对操作者的　专业技术要求高，故临床广泛应用受到一定的限制。　也有学者利用集落生成法来预测采集时机＿６］，因方　法较复杂、各实验室缺乏统一的标准、结果判定有较　大的主观性、费时较长，不利于快速判断最佳采集时　机。国内外学者有应用Ｓｙｓｍｅｘ系列具有幼稚细胞　通道（ＭＩ）的血细胞分析仪进行外周血干／祖细胞检　测（ＨＰＣ），发现ＨＰＣ始终与传统的造血干／祖细胞　检验参数ＣＤ３４　细胞计数和ＣＦＵ—ＧＭ计数存在良　好的直线相关关系，而且发现：利用ＭＩ通道和　ＦＣＭ不同的检测原理进行的ＨＰＣ和ＣＤ３４　细胞　检测，检测出来的实际上是不同的前体细胞群　。　作者利用Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ２０００Ｉ全自动血细胞分析仪上　的ＶＣＳ技术（即体积、射频、激光技术）及化学染色　原理，通过射频、激光检测出细胞的大小，而且通过　染色，根据细胞的染色及细胞核的密度，采用物理和　化学方法，把各种细胞分为不同的区域，识别出动员　后外周血造血干／祖细胞所分布的细胞群，即计数出　外周血循环幼稚细胞数（ＰＢＣＩＣ）。作者发现ＰＢＣＩＣ　与ＣＤ３４　细胞之间、ＰＢＣＩＣ与ＣＦＵ—ＧＭ计数之间　有良好的相关性。Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ２０００Ｉ较具有ＭＩ通　道的Ｓｙｓｍｅｘ系列细胞分析仪更经济、实用，临床应　用更为广泛。而且根据Ｓｙｓｍｅｘ　ＸＴ２０００Ｉ全自动血　细胞分析仪的工作原理，有理由认为它检测出的　ＰＢＣＩＣ可能与有ＭＩ通道的ＨＰＣ检测出的细胞存　在一定差异，但是否正确有待进一步确定。　目前还有许多研究致力于开发外周血干／祖细　胞监测的方法，比如：镜下计数未成熟细胞监测外周　血干细胞的动员过程，人为因素影响较大不易定量。　［１１李莆．Ｇ—ＣＳＦ加化疗诱导动员后祖细胞采集时机对外周血中　循环幼稚细胞的预测价值ＥＪ３．国外医学：输血及血液分册，　２００３，２６（３）：２８６．　［２３　Ｇｒｉｇｇ　Ａ　Ｐ，Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ａ　Ｗ，Ｒａｕｎｏｗ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　Ｄｏｓｅ　ａｎｄ　Ｓｃｈｅｄｕｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｃｏｌｏｎｙ—ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）ｆｏｒ　Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｒｏ—　ｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ［Ｊ３．Ｂｌｏｏｄ。１９９５，８６：４４３７—　４４４５．　Ｅ３］ＤｅｍｉｒｅｒＴ，ＢｕｃｈｎｅｒＣＤ，Ａｐｐｅｌｂａｕｍ　ＦＲ，ｅｔ　ａ１．ＲａｐｉｄＥｎ—　ｇｒａｆｔｍｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｍａｒｒｏｗ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ－ｍｏ—　ｂｉｌｉｚｅｄ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｉｌｓ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａｃｕｔｅ　Ｍｙ—　ｅｌｏｇｅｎｏｕｓ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ３．Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１　９９５，１５：　９１５—９２２．　［４］Ｂａｒｎｅｔｔ　Ｄ，Ｊａｎｏｓｓｙ　Ｇ，Ｌｕｋｅｎｋｏ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ３４　Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌ１．　Ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＣＤ３４　Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｐａｒｔｙ．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　Ｔａｓｋ　Ｆｏｒｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｃｏｍ—　ｍｉｔｔｅｅ　ｆｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｉｎ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ　Ｈａｅｍｔｏｌ，　１９９９，２１（５）：３０１－３０８．　［５］吴玲玲，张葵，陈军浩，等．外周血ＣＤ３４　细胞计数预测造血干　细胞收获量［Ｊ］．现代检验医学杂志，２００４，１９（２）：Ｉ４－Ｉ５．　［６］李志祥，谢桂岚．用集落生成法探讨外周血干细胞采集时机　ＥＪ３．基础医学与临床，２００４，２４（１）：１０４—１０５．　［７］郭婧婧，武四云，陈远林．外周血造血干细胞最佳采集时机的快　速判断方法［Ｊ］．中南大学学报（医学版），２００５，３０（５）：５７０—　５７３．　［８］Ｐｏｌｌａｒｄ　Ｙ，Ｗａｔｔｓ　Ｍ　Ｊ，Ｇｒａｎｔ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｅｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｙｓｍｅｘ　ＳＥ２９５００　ｔｏ　Ｒｅｆｉｎｅ　Ａ—　ｐｈｅｒｅｓｉｓ　Ｔｉｍｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒｅａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｈａｅｍａｔｏｌ，１９９９，１０６（２）：５３８—５４４．　［９］Ｓａｉｇｏ　Ｋ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ　Ｔ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒｅａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｈａｒｖｅｓｔ　ｂｙ　Ｕｓｉｎｇ　ａｎ　ＳＥ一９０００　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０００，　１０３（３）：Ｉ５７－Ｉ６１．　ＥｌＯ３　杨申淼，刘开彦，陆道培．外周血造血干／祖细胞动员与采集时　动态快速监测造血祖细胞的意义［Ｊ３．中国实验血液学杂志，　２００３，１１（３）：２９２—２９６．　Ｅｌｌ３　沈大江，张鹏．ＳＥ２９５００血细胞计数仪ＩＭＩ通道检测外周血干　细胞ＥＪ］．临床检验杂志，２００２，２０（２）：９８—９９．　（责任编辑：潘小玲）