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网络出版时间:２０１９－５－３０１０:５１ 网络出版地址:ｈｔｔｐ://ｋｎｓ.ｃｎｋｉ.ｎｅｔ/ｋｃｍｓ/ｄｅｔａｉｌ/３４.１０６５.ｒ.２０１９０５２７.１６４８.０１４.ｈｔｍｌ
基于ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术筛选高转移胃癌细胞
系ＨＧＣ￣２７核酸适配体
刘 涛１ꎬ王进军２ꎬ方晓娜２ꎬ何 磊２ꎬ杨伟丽２ꎬ罗昭锋２ꎬ王亚雷１
摘要 目的 筛选针对高转移胃癌细胞(ＨＧＣ￣２７)的核酸适配体ꎮ方法 以ＨＧＣ￣２７为靶细胞ꎬ以ＡＧＳ为反筛细胞ꎬ利用Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术逐轮次筛选ꎬ从文库中挑选能与ＨＧＣ￣２７结合的核酸适配体ＬＷ￣２５ꎮ用流式细胞术检测核酸适配体测富集程度ꎬ核酸适配体与ＨＧＣ￣２７的亲和力及特异性ꎮ结果 流式细胞仪显示随着筛选轮数的增加ꎬ次级文库与靶细胞结合的荧光强度增强ꎮ从次级文库中成功挑选出一条能与ＨＧＣ￣２７结合的核酸适配体ＬＷ￣２５ꎮ并且ＬＷ￣２５能特异性识别ＨＧＣ￣２７ꎮ胰蛋白酶处理ＨＧＣ￣２７后ꎬＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣
２０１９－０３－０５接收
２７的结合能力较处理前明显下降ꎮ结论 核酸适配体ＬＷ￣２５能特异性识别ＨＧＣ￣２７ꎬ是潜在具有诊断胃癌转移的分子探针ꎮ
关键词 核酸适配体ꎻ胃癌ꎻ转移中图分类号 Ｒ７３５
文献标志码Ａ文章编号１０００－１４９２(２０１９)０６－０９３３－０５ｄｏｉ:１０.１９４０５/ｊ.ｃｎｋｉ.ｉｓｓｎ１０００－１４９２.２０１９.０６.０２０
胃癌是消化系统的常见的恶性肿瘤ꎬ转移与侵袭是患者死亡的主要原因ꎮ大约５０％患者在胃癌确诊时已经发生了转移[１]ꎮ由于胃癌主要通过淋巴结转移[２]ꎬ因此及时准确的判断有无淋巴结转移对于胃癌的治疗方式选择及预后评价至关重要ꎮＣＴ及ＭＲＩ是目前临床上判断胃癌是否发生转移最常用的检测手段ꎮ然而ꎬ这种诊断方法主要根据病变部位形态学特征ꎬ不能从分子水平早期判断是否发生转移ꎮ核酸适配体(ａｐｔａｍｅｒ)是一类人工合成
基金项目:安徽省公益性技术应用研究联动计划项目(编号:作者单位:１安徽医科大学第一附属医院消化内科ꎬ合肥 ２３００２２
２
１５０１１ｄ０４０４３)
中国科学技术大学生命科学院ꎬ合肥 ２３００２７
作者简介:刘 涛ꎬ男ꎬ硕士研究生ꎻ
王亚雷ꎬ男ꎬ副教授ꎬ主任医师ꎬ硕士生导师ꎬ责任作者ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ａｌｅｉ４１６＠１６３.ｃｏｍ
Ｅｆｆｅｃｔｏｆｂｕｒｎｅｄ￣ｒａｔｓｅｒｕｍｏｎｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ
２
ＤｅｐｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ ２３００２２)
(１ＤｅｐｔｏｆＢｕｒｎꎬＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ ２３００２２ꎻ
ＤｕａｎＳｈｅｎｇｌｉａｎｇ１ꎬＨｕＺｉｊｉａｎ２ꎬＭｅｎｇＣｈｅｎｇｙｉｎｇ１ꎬｅｔａｌ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｕｒｎｅｄ￣ｒａｔｓｅｒｕｍｏｎｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａ￣
ｎｉｓｍ.Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔａｏｒｔｉｃｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐａｎｄｓｅｒｕｍｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｏｒｔｉｃｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｏｒ２４ｈｗｉｔｈｂｕｒｎｅｄ１２ｈｓｅｒｕｍ.Ｃｅｌｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｈａｎｇｅｓｉｎｍｏｎｏ￣ｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｃｅｌｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｓｅｒｕｍｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<
ｇｒｏｕｐａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｗｈｅｔｈｅｒｏｒｎｏｔｔｏａｐｐｌｙｂｕｒｎｓｅｒｕｍｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎꎬｓｅｒｕｍｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒｅａｔｒａｔ１ꎬＥＴＡꎬＥＴＢａｎｄＺＯ￣１ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<００１)ꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＺＯ￣１ｉｎｓｅｒｕｍｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｓｅｒｕｍｏｆｂｕｒｎｅｄｒａｔｓｃａｎｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｔｈｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎬａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＴ￣１ꎬＥＴ￣ＡꎬＥＴ￣ＢａｎｄｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆＺＯ￣１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｂｕｒｎｓꎻｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓꎻｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙꎻＥＴ￣１ꎻＺＯ￣１
ｌａｙｅｒｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆｃｅｌｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓＥＴ￣
００１)ꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆｃｅｌｌｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓＥＴ￣１ꎬＥＴＡａｎｄＥＴＢｉｎｓｅｒｕｍ
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安徽医科大学学报 ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ ２０１９Ｊｕｎꎻ５４(６)
的短链单链ＤＮＡ或者ＲＮＡꎬ可以与靶标特定结构结合产生类似“抗原－抗体”反应ꎬ故又称之为“化学抗体”ꎮ因此ꎬ该研究利用目前常用的细胞－配体指数富集系统进化[３](ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇ￣ａｎｄｓｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔꎬＣｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ)技术筛为胃癌早期转移的分子诊断提供基础ꎮ１ 材料与方法１.１ 主要材料
１.２.１.２ 消减筛选 将预处理文库与ＨＧＣ￣２７细胞在４℃振荡孵育１２０ｍｉｎꎬ去上清液ꎬ加入２ｍｌ洗涤缓冲液ꎬ洗涤２次ꎮ加入２００μｌ超纯水(ｄｄＨ２Ｏ)ꎬ用细胞刮刀将细胞转移至离心管ꎮ１００(ｓｓＤＮＡ)ꎮ
℃热变性１０ｍｉｎꎬ收集与ＨＧＣ￣２７结合的单链ＤＮＡ１.２.２ 亚文库制备 将ｓｓＤＮＡ与配置含有ＦＡＭ修饰及碱基Ａ加长的引物的ＰＣＲ扩增体系涡旋混合ꎬ然后加入６ｍｌＥＭ９０矿物油振荡混匀ꎬＰＣＲ扩增ꎬ９８℃变性３ｍｉｎꎬ进行１５~２５个循环ꎬ９８℃变性选特异性识别高转移性胃癌细胞株的核酸适配体ꎬ
１.１.１ 细胞系 人胃癌细胞株ＨＧＣ￣２７(高转移能力)ꎬＡＧＳ(无转移能力)购自中国科学院上海细胞库ꎻ肺癌细胞Ａ５４９、肝癌细胞Ｈｅｐ３Ｂ及ＨｅｐＧ２、结肠癌细胞ＳＷ４８０、乳腺癌细胞ＭＣＦ￣７ꎬ均为本实验室保存ꎻ人胚肾细胞ＨＥＫ￣２９３为中国科学技术大学生命科学院惠赠ꎻ实验所用细胞均处于对数期ꎮ
１(５′￣ＴＴＣＡＧＣＡＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＧＣ￣Ｎ４０￣ＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧ￣.１.２ 随机ＤＮＡ文库及引物 随机单链ＤＮＡ文库ＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ￣３′)ꎬＣＡＣＧＣＡＴＡＧＣ￣３′(引物:５′￣ＦＡＭ￣ＴＴＣＡＧＣＡＣＴＣ￣ＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ￣３′(上游荧光素标加长标记引物)由上海生工生物工程公司合成上记游引１８物个)、５′￣１８Ａ￣碱ꎮ基ＡＮＥＢ１.１.３ 公司主要试剂)ꎻＰＭＩ￣１６４０ Ｑ５及高保真(杭州四季青公司ＤＭＥＭＤＮＡ培养基聚合酶()ꎻ美国(英国ｃｌｏｎｅ公司)ꎻ胎牛血清杜氏磷Ｈｙ￣酸盐缓冲液ｍａ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ)、酵母ｔＲＮＡ购自美国Ｓｉｇ￣公司公司ꎻ无ꎻ酶葡萄糖以及消化液(北ＢＳＡ京普购自上海生工生物工程利莱基因技术有限公司)ꎻＥＭ９０矿物油由中国科学技术大学生命科学院配置并提供ꎮ洗涤缓冲液以及结合缓冲液由实验室自行配ｍｍｏｌ置:洗涤缓冲液(含４５ｇ/Ｌ葡萄糖(涤缓冲液含有/Ｌ０ＭｇＣｌ及５１)ꎮｍｇ２其他试剂均为国产分析纯/的杜氏磷酸盐缓冲液ｍｌ酵母ｔＲＮＡ和１ｍｇ)ꎻ/ｍｌ结合缓冲液ꎬ实验用水ＢＳＡ的洗为过滤除菌的超纯水ꎮ
１.１.４ 主要实验仪器 ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ５流式细胞仪(美国ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ公司)ꎻＡＢＩ７５００ＰＣＲ扩增仪(美国Ｔｈｅｒｍｏ公司)ꎻＣＬＭ￣１７０Ｂ￣８￣ＮＦ型ＣＯ养箱(上海Ｅｓｃｏ公司)ꎮ２培１.２ 方法 参照文献[４]采用Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术ꎮ１.２.１ 核酸适配体筛选
１.２.１.１ 文库处理 单链ＤＮＡ文库１３ｎｍｏｌ溶解于ｍｉｎ１后３ꎬｍｌ加入洗涤缓冲液中２００μｌ结合缓冲液ꎬ９５℃变性ꎮ１０ｍｉｎꎬ冰浴１０１０伸３ｓꎬ６８ｍｉｎꎮ℃复性ＰＣＲ２０产物加入ｓꎬ７２℃１６延伸ｍｌ２０正丁醇振荡混匀ｓꎬ最后７２℃延９０００ｒ/ｍｉｎ、１０ｍｉｎꎮ弃上清液ꎬ沉淀物利用８％变ꎬ
５性ＰＡＧＥ胶电泳分离、浓缩得到ｓｓＤＮＡ文库ꎮ从第３０轮开始先将上一轮１.２~.６０３ ｍｉｎꎬ高特异性及亲和力次级文库上层清液用于正筛ｓｓＤＮＡ文库与ꎮ
ＡＧＳ细胞孵育 为了提高筛选所得核酸适配体的亲和力和特异性ꎬ在筛选过程中改变部分筛选条件ꎬ反筛选的孵育时间由３０ｍｉｎ逐渐增加至６０ｍｉｎꎬ正筛选的孵育时间由１２０ｍｉｎ逐渐减少至６０ｍｉｎꎬ提高正筛选的洗涤强度ꎬ包括洗涤次数和时间、洗涤液的体积ꎬ并在孵育过程中加入胎牛血清以降低非特异性结合ꎮ
１ＤＮＡ.２.４ 文库富集程度分析 用流式细胞术监测ｓｓ￣胞ＨＧＣ￣２７文库中核酸适配体的富集程度两次ꎬ加入无酶消化液收集靶细胞.ＰＢＳ洗涤靶细.将终浓度为２００ｎｍｏｌ/Ｌ的ｓｓＤＮＡ文库与约４×１０６个靶细胞４℃孵育６０ｍｉｎꎬ洗涤缓冲液洗２次后流式细胞仪检测荧光强度ꎬ以ＦＡＭ标记的随机ＤＮＡ序列做为对照ꎮ核酸适配体亲和力测定及细胞特异性考察时采用上述相同的实验操作方法ꎮ
１.２.５ 筛选产物测序及分析 筛选产物的克隆和测序ꎮ经过１１轮的筛选后ꎬ产物用不带标记的引物进行ＰＣＲ扩增后ꎬ由天津诺禾致源生物信息科技公司进行高通量测序工作ꎮ用ＣｌｕｓｔａｌＸ软件进行序列同源性比对ꎬ从每个家族中挑出序列富集度最高进行ＦＡＭ荧光修饰合成并进行亲和力鉴定ꎮ
１６.的核酸适配体样品个浓度梯度２.６ 核酸适配体与靶标亲和力分析(５０、１００、２００、３００、 平行设置Ｙ(重复３次)与靶细胞孵育４００、５００ｎｍｏｌꎬ根据/Ｌ)分析饱和结合曲线获得解离常数＝ＢｍａｘＸ/(Ｋｄ＋Ｘ)方程ꎬ用ＧｒａｐｈＰａｄ(Ｋｄ)ꎮＰｒｉｓｍ软件１.２.７ 核酸适配体与靶标特异性分析 核酸适配体对靶细胞株的特异性识别能力是其作为特异性分安徽医科大学学报 ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ ２０１９Ｊｕｎꎻ５４(６)
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子识别探针的关键ꎮ将挑选的核算适配体与胃癌细胞ＨＧＣ￣２７、肝癌细胞ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、结肠癌细胞ＳＷ４８０、肺癌细胞Ａ５４９、乳腺癌细胞ＭＣＦ￣７及人胚肾细胞ＨＥＫ￣２９３进行结合反应ꎬ操作同上ꎬ流式细１.２.８ 核酸适配体与靶标结合位点化学性质初步分析 ＰＢＳ洗涤靶细胞ＨＧＣ￣２７两次ꎬ然后分别加入５００μｌ胰蛋白酶以及无酶消化液ꎬ室温消化２洗涤ꎮ然后按上述操作步骤进行亲和力测定ꎮｍｉｎ后迅速加入２ｍｌＰＢＳ(含１０％ＦＢＳ)ꎬ终止消化ꎬ１.３ 统计学处理 采用ＳＰＳＳ２２０软件进行分析ꎬ
实验数据以ｘ±ｓ表示ꎮ两组之间比较采用ｔ检验ꎬ以Ｐ<００５为差异有统计学意义ꎮ２ 结果
２.１ 高转移胃癌细胞株ＨＧＣ￣２７核酸适配体筛选 采用流式细胞术监测筛选文库与靶细胞的亲和富集程度ꎬ结果如图１所示ꎮ随着筛选轮数的增加ꎬ次级文库与靶细胞株ＨＧＣ￣２７结合的荧光强度逐渐增加ꎬ表明次级文库能与靶细胞株ＨＧＣ￣２７结合的核酸适配体逐渐富集ꎻ而次级文库与对照细胞株ＡＧＳ细胞株荧光强度无明显变化ꎬ表明次级文库具有较强特异性ꎮ同时ꎬ流式细胞术显示第１１轮与第筛选文库进行克隆测序ꎮ对次级文库进行ＰＣＲ扩增ꎬ高通量测序ꎮ根据测序结果及ＣｌｕｓｔａｌＸ分析ꎬ选择的同源性及富集程度最高的７条序列进行化学合成ꎬ流式细胞仪分析表明只有一条对靶细胞株见表１ꎮ
ＨＧＣ￣２７具有较强结合能力的核酸适配体ＬＷ￣２５ꎮ胞术观察荧光强度ꎮ
２.２ 核酸适配体的亲和力考察 通过Ｇｒａｐｈ￣Ｐａｄ.
１２１ｎｍｏｌ/Ｌꎬ见图２ꎮ表明筛选得到的核酸适配体ＬＷ￣２５与靶细胞株有高的亲和性ꎮ
Ｐｒｉｓｍ７０软件分析得知ꎬＬＷ￣２５的解离常数(Ｋｄ)为
图２ 适配体ＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣２７亲和力分析
２.３ 核酸适配体特异性考察 利用流式细胞术考察核酸适配体与靶细胞ꎬ其他肿瘤细胞系及人４００ｎｍｏｌ/Ｌ)ꎮ如图３所示ꎬ筛选得到的核酸适配体ＬＷ￣２５特异性与靶细胞结合ꎬ可以很好地区分识别肝癌、结肠癌、肺癌以及ＨＥＫ￣２９３ꎬ表现出对靶细胞２.４ ＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣２７结合位点化学性质初步分析 如图４所示ꎬ核酸适配体ＬＷ￣２５与经胰蛋白酶处理后ＨＧＣ￣２７细胞株结合荧光强度(蓝色线条)ꎬ明显低于其与未经胰蛋白酶处理的同种细胞(红色线条)ꎬ表明其结合位点可能为蛋白质ꎮ３ 讨论
２位ꎬ其预后与分期密切相关ꎮ由于胃癌主要通过淋巴结转移ꎬ因此术前准确评估有无淋巴结转移对于胃癌分期以及治疗方式选择至关重要ꎮ对于无淋巴结转移的早期胃癌可通过ＥＳＤ术治疗ꎬ对于进展期胃癌可通过外科手术治疗或化疗ꎮ目前临床上手术前判断胃癌有无淋巴结转移主要依赖ＣＴꎬＭＲＩ及ＰＥＴ￣ＣＴꎮ研究[５]分析表明这些检测技术在诊断胃癌有无淋巴结转移存在一定不足ꎮ病理学上常利用 胃癌是继肺癌之后在全球癌症相关死因中排第株的高度特异性ꎮ
转移性胃癌细胞与其他类型肿瘤细胞株如乳腺癌、ＨＥＫ￣２９３细胞系的结合情况(核酸适配体终浓度
９轮荧光强度无明显变化并且达到最大值ꎬ因此将
图１ 不同轮数的筛选产物与细胞结合的流式细胞术测定结果 Ａ:各轮文库与ＨＧＣ￣２７细胞株结合荧光强度ꎻＢ:各轮文库与ＡＧＳ细胞株结合荧光强度
表１ ＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣２７细胞株的结合平衡解离常数
核酸适配体序列(５′￣３′)Ｋｄ(ｎｍｏｌ/Ｌ)
ＬＷ￣２５ＴＴＣＡＧＣＡＣＴＣＣＡＣＧＣＡＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＣＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＣＧＧＡＣＣＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＡＡ１２１±２８
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图３ 核酸适配体ＬＷ￣２５与靶细胞株结合特异性分析
Ａ:ＨＧＣ￣２７ꎻＢ:ＡＧＳꎻＣ:Ａ５４９ꎻＤ:Ｈｅｐ３ＢꎻＥ:ＳＷ４８０ꎻＦ:ＭＣＦ￣７ꎻＧ:ＨｅｐＧ２ꎻＨ:ＨＥＫ￣２９３
高ꎬ易穿透肿瘤组织ꎬ是一类具有重大应用潜能的分
７７０２为反筛细胞ꎬ成功筛选出识别特异性识别肝癌细胞ＨｅｐＧ２的核酸适配体ＨＡ０９ꎬ并且能够区分肝癌组织与正常组织ꎮＷｕｅｔａｌ[１０]基于Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术筛选出核酸适配体ＸＱ￣２ｄ不仅能特异性识别胰腺导管癌细胞ꎬ而且在鉴别胰腺癌组织与正常胰腺组织上显示出较高的诊断价值ꎮ同时ＸＱ￣２ｄ能
连续切片技术ꎬ免疫组化以及逆转录￣聚合酶链式反应(ＲＴ￣ＰＣＲ)技术来检测胃癌是否有早期转移(淋巴结微转移)ꎬ然而这些技术存在操作繁琐ꎬ准确率较低以及假阳性高等问题ꎮ
核酸适配体是继抗体之后又一类被广泛应用的
[６]
子研究工具[８]ꎮ
近年来ꎬＣｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术被广泛运用于筛选识别肿瘤细胞的分子探针－核酸适配体ꎮＬｕｅｔａｌ[９]以肝癌细胞株ＨｅｐＧ２为正筛细胞ꎬ肝实质细胞ＨＬ￣
图４ 胰蛋白酶处理对ＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣２７结合荧光强度的影响
够特异性识别小鼠体内被接种上胰腺导管癌的肿瘤组织ꎮ
目前已筛选的胃癌细胞核酸适配体多以ＡＧＳ或ＳＧＣ￣７９０１为正筛细胞ꎬ胃正常上皮细胞ＧＥＳ￣１为反筛细胞ꎬ这些核酸适配体只能用于胃癌早期诊断而对于胃癌转移没有诊断价值[１１－１２]ꎮ因此ꎬ本研究以高转移胃癌细胞ＨＧＣ￣２７为正筛细胞ꎬ无转移特性胃癌细胞ＡＧＳ为反筛细胞ꎬ建立了细胞核酸适配体筛选平台ꎬ对筛选过程ＰＣＲ方法进行改进ꎬ成功筛选出一条针对高转移胃癌细胞的核酸适配体并且具有较高亲和力及特异性ꎮ同时胰蛋白酶消化处理后ꎬＬＷ￣２５与ＨＧＣ￣２７几乎没有结合ꎬ初步提示靶标分子可能为蛋白ꎮ
在本研究中一些技术环节上的改进ꎬ如在Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ过程中的扩增环节采用乳化液ＰＣＲ技术ꎮ相对于传统的ＲＣＰ扩增容易引起偏好扩增以及非
生物靶向分子ꎬ具有很强的亲和力及特异性ꎮ２００６
年谭蔚泓院士课题组率先提出Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ技术ꎬ通过该技术能在不清楚或不能区分完整细胞上的靶标的情况下ꎬ获得一组识别不同细胞的核酸适配体分子探针ꎮ其自身能够折叠形成特定的空间结构ꎬ通过氢键、疏水作用、范德华力等非共价作用力与靶标特异性、高亲和性结合[７]ꎮ其与靶标的结合机制与抗体抗原的作用机制相类似ꎬ因此核酸适配体又被称为“化学抗体”ꎮ与传统的生物抗体相比ꎬ核酸适配体与靶标结合不仅具有较高特异性和亲和力ꎬ并且易于快速化学合成、低免疫原性、毒性小ꎬ稳定性
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特异性扩增ꎬ乳化液ＰＣＲ扩增的优势在于[１３]:①可以把不同的ＤＮＡ片段分在不同的乳化液颗粒中单独进行ＰＣＲ扩增ꎬ避免了引物间以及不同种类产物间相互杂交ꎬ消除了非特异性产物ꎮ②能消除不同产物间的竞争抑制ꎬ避免了传统ＰＣＲ优先扩增短链ＤＮＡ片段问题ꎮ③高通量ꎬ能同时扩增多达１０个
８
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不同的ＤＮＡ模板ꎬ且产物量多于传统ＰＣＲꎮ④灵敏度高ꎬ能把文库中极微量ＤＮＡ扩增出来ꎬ解决了扩增中出现偏好扩增ꎻ同时采用高保真Ｑ５扩增酶ꎬ能够有效减少实验过程的污染序列对扩增干扰ꎮ
参考文献
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ｎｏｍａｃｅｌｌ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡａｐｔａｍｅｒｂｙｌｉｖｅｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ[Ｊ].Ｏｎｃｏｌ
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[１３]ＳｈａｏＫꎬＤｉｎｇＷꎬＷａｎｇＦꎬｅｔａｌ.ＥｍｕｌｓｉｏｎＰＣＲ:ａｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｗａｙｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｎｄｏｍＤＮＡｌｉｂｒａｒｉｅｓｉｎａｐｔａｍｅｒｓｅ￣ｌｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１１ꎬ６(９):１－７.
[５] ＳｅｅｖａｒａｔｎａｍＲꎬＣａｒｄｏｓｏＲꎬＭｃｇｒｅｇｏｒＣꎬｅｔａｌ.Ｈｏｗｕｓｅｆｕｌｉｓｐｒｅ￣
Ｃｅｌｌ￣ＳＥＬＥＸ￣ｂａｓｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆａｐｔａｍｅｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｈｉｇｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｅｔａｓｔａｔｉｃｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ(ＨＧＣ￣２７)
(１ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙꎬＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｅｆｅｉ ２３００２２ꎻ
２
ＬｉｕＴａｏ１ꎬＷａｎｇＪｉｎｊｕｎ２ꎬＦａｎｇＸｉａｏｎａ２ꎬｅｔａｌ
ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｈｉｎａꎬＨｅｆｅｉ ２３００２７)
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｓｃｒｅｅｎａｐｔａｍｅｒｓｂｉｎｄｉｎｇｈｉｇｈｌｙｍｅｔａｓｔａｔｉｃｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ(ＨＧＣ￣２７).Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＨＧＣ￣２７ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔａｒｇｅｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄＡＧＳｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｅｌｌｓ.ＡＤＮＡａｐｔａｍｅｒｎａｍｅｄＬＷ￣２５ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔＨＧＣ￣２７ｃｅｌｌｓｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌ￣ｂａｓｅｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇａｎｄｓｂｙｅｘ￣ｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ(ＳＥＬＥＸ)ｍｅｔｈｏｄ.ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｏｎｉｔｏｒｔｈｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄＤＮＡｐｏｏｌꎬａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｉｅｓｏｆＬＷ￣２５.Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｓｕｂｐｏｏｌｓｂｉｎｄｉｎｇａｇａｉｎｓｔＨＧＣ￣２７ｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｌｏｎｇｗｉｔｈｓｅｌｅｃｔｉｏｎｒｏｕｎｄｓ.ＷｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄａａｐｔａｍｅｒｎａｍｅｄＬＷ￣２５ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｉｎｄａｇａｉｎｓｔＨＧＣ￣２７ｃｅｌｌｓ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｒｙｐｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｅａｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｏｆＬＷ￣２５ｔｏＨＧＣ￣２７ｃｅｌｌｓ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｅｓｅｓｔｕｄｉｅｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓＨＧＣ￣２７ｓｐｅｃｉｆｉｃａｐｔａｍｅｒＬＷ￣２５ｍａｙｂｅａｐｏｔｅｎ￣ｔｉａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｔｏｒｅｃｏｇｎｉｚｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ａｐｔａｍｅｒꎻｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒꎻｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
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