western blot实验步骤

一、实验目的

通过实验了解western blot技术的原理和操作。

二、实验原理

SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。

化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。

三、实验器材

1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床

7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜

四、实验试剂

1.runningbuffer

5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g

Glycine 94.0g SDS 5.0g

ddH2O 定容至1L 使用前稀释5倍 2.Transfer buffer

10×Transfer buffer(1L)

Tris 30.3g Glycine 144.0g ddH2O 定容至1L

使用前稀释10倍，加入1/4体积的甲醇 3.TBS

10×TBS(500mL)

Tris 12.1g Nacl 40.0g

ddH2O 定容至500mL 用HCl调节溶液的pH值至7.6 4.TBST(1L)

1×TBS:Tween-20=1000:1 ddH2O定容至1L

5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)

脱脂奶粉 2.5g

TBST 定容至50ml 6.一抗溶液 7.二抗溶液

8.显影液现配现用，溶液A：溶液B=1:1配置。 9.SDS-PAGE（配方见下一页）

五、操作步骤

1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.1SDS-PAGE胶的配置

①先清洗胶板，用去离子水冲洗后放在架子上待干。 ②准备好试剂。

③计算所需要使用试剂的量。

例：6%的分离胶，每块胶板分离胶约需要7ml，10块胶，共需要70ml

④将胶板安装在架子上，较低的板朝外，注意底部要平，以防漏胶。较高的板有正反之分，上面的“up”朝上。 ⑤准备配胶按照上面配方依次添加。 注意：1.添加量少的试剂要注意混匀 2.TEMED，APS要最后加

⑥配好分离胶，将胶液注入胶板缝隙中。注意速度不能太慢，否则胶液会凝，越是浓度高的胶液凝的越快。 ⑦分离胶加入后，用异丙醇或水封平胶面，注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢

不要过分冲击胶，否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。 ⑧半小时后观察分离胶是否凝结，左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。凝结后，将异丙醇或水到掉，将架子倒置去除多余的异丙醇或水。

⑨配置浓缩胶，同配置分离胶相似，配方不同。配好后倒胶。每块胶用约3ml。 注意不要到过多的浓缩胶，以防插梳子后胶会溢出，倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。且倒胶后应尽快插梳子，注意梳子有正反。

A.分离胶

6%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 8%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 10%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 12%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 5ml 2.1 1.5 0.05 0.05 0.002 7ml 2.94 2.1 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 3.36 2.4 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 5ml 2.35 1.25 0.05 0.05 0.002 7ml 3.29 1.75 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 3.76 2 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 4.7 2.5 2.6 0.1 0.1 0.004 5ml 2.6 1 0.05 0.05 0.003 7ml 3.64 1.4 1.82 0.07 0.07 0.0042 8ml 4.16 1.6 2.08 0.08 0.08 0.0048 10ml 5.2 2 2.6 0.1 0.1 0.006 5ml 2.85 0.75 0.05 0.05 0.004 7ml 3.99 1.05 1.82 0.07 0.07 0.0056 8ml 4.56 1.2 2.08 0.08 0.08 0.0064 10ml 5.7 1.5 2.6 0.1 0.1 0.008 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 15%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED

5ml 1.725 1.875 0.05 0.05 0.002 7ml 2.415 2.625 1.82 0.07 0.07 0.0028 8ml 2.76 3 2.08 0.08 0.08 0.0032 10ml 3.45 3.75 2.6 0.1 0.1 0.004 1.5Mtris-HCl（pH8.8） 1.3 B.浓缩胶

5%GEL H2O 40%Acr/bis 10%SDS 10%AP（过硫酸铵） TEMED 2.02ml 1.48 0.25 0.02 0.02 0.002 4.04ml 2.96 0.50 0.50 0.04 0.04 0.004 6ml 4.44 0.75 0.75 0.06 0.06 0.006 10ml 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 1.0Mtris-HCl（pH6.8） 0.25

1.2 凝胶电泳

①将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净，把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。注意：胶板较短的一侧朝内。 ②往电泳槽内注入running buffer，如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将running buffer加超过上样孔，但也不要漫过胶板最上方。 ③根据自己需求上样。 ④盖上电泳槽的盖子，注意电极的正负。插上电源，打开电源，设置时间和电压。一般需要设置两次时间，浓缩胶100v，0.5h；分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。分离胶浓度越低，蛋白样跑的越快。 ⑤开始电泳。

2.转膜（半干转）

① 转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。在转膜前要将NC膜先放在去离子水中浸泡几分钟，因为直接将NC膜泡在Transferring buffer 中会导致NC膜变的很皱。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。）

② 在加有Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。 ③ 将转膜仪打开，在上面垫浸泡过的滤纸，用试管取一些Transferring buffer

轻轻倒在上面，再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。 ④ 在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触，然后两边慢慢放下。 ⑤将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 记住正反面，切去一角已标记方向。

⑥小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶，后用手拿着胶的轻轻置于NC膜上，注意胶的中间要先与NC膜接触，然后慢慢放下，以防有气泡。用手调整使其与NC膜对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 ⑦在最上面铺上最后一层滤纸。

⑧用纸吸取多余的Transferring buffer。

⑨盖上转膜仪的盖子，插上电源，打开电源，设置时间和电压，25v，45min。

3.免疫反应

1.取出NC膜于，用剪刀减去多余的NC膜部分，用同样的方法剪去一个角，标记正反。将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次，10分钟/次，倒去TBS液。 2.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。 3.一抗（1：10000）孵育4℃过夜。

4.取出NC膜，用TBST在摇床上洗三次，每次15min。 5.封闭：加入5%的脱脂奶粉溶液，1h，倒去。 6.用同样的方法，二抗（1：10000）孵育，1h。 7.取出NC膜，用TBST洗三次，每次15min。

4.显影

①取两张塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。将其中一张铺在X射线摄影暗匣里。 ②按照1：1配制好显影液，混匀。

③将NC膜平铺在第一张塑料膜上，将显影液均匀的铺在NC膜上,左右摇晃X射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。

④将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面，用胶布粘住四边固定。盖好夹子。

⑤在暗室里，打开夹子，取四张X射线胶片将其小心盖在塑料膜上，覆盖住NC膜。注意当X射线胶片盖上后就不能再横向移动，否则荧光会错位影响结果。 ⑥在暗室里观察荧光情况，若所用的标签蛋白比较亮，就计时1min；否则，计时10min。盖上夹子，计时。

⑦小心取出X射线胶片，减掉一个角以表明正反。然后放入自动显影机中显影。 ⑧拿到显影后的X射线胶片，用标签笔标记时间，Marker大小，上样信息等必要的数据。