生物化学实验

2.装柱将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，把处理好的凝胶连同适当体积的蒸馏水用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中。最好一次连续装完

所需的凝胶，若分次装入，需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长8cm，最后放入略小于层析

柱内径的滤纸片保护凝胶床面。注意：整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当重新装柱。3

.平衡用蒸馏水洗脱，调整流量，使胶床表面保持2cm液层，平衡20min。4.样品制备取2mL抗凝血放入试管中，加入等体积

的铜盐溶液，混匀待用。5.上样当胶床表面仅留约1mm液层时，吸取0.5mL血红蛋白与铜盐混合样品溶液，小心地注入层析柱

胶床面中央，注意切勿冲动胶床，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床、床面上仅有1mm液层时，用乳头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进

入胶床，然后用滴管小心加入3～5cm高的洗脱蒸馏水。6.洗脱继续用蒸馏水洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约

6滴。观察并记录实验现象。最后用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。四、结果描述并解释实

验现象，讨论凝胶过滤的效果。五、思考题1.凝胶过滤又称为分子筛，大小不同的分子经过凝胶过滤被洗脱出来的次序与一般普通

过滤有什么不同？为什么？2.凝胶过滤在生物化学实验研究中有哪些用途？实验7DNA的琼脂糖凝胶电泳一、目的

与要求掌握琼脂糖凝胶电泳的方法和原理二、原理凝胶电泳是分离与测定生物大分子的一项重要技术，琼脂糖糖凝胶电泳或

聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定及纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简单、快速，可以分辨用其他方法不能分辨的DNA片段。

DNA

溶液在pH8.0时带负电，在电泳电场中向正极移动，用聚丙烯酰胺分离小片段DNA（5～500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1

bp的DNA片段都能分开。琼脂糖凝胶的分辨能力虽低，但其分离的范围较广，可以分离长度为200bp～50000bp的DNA。

本实验采用的是琼脂糖凝胶电泳，它常用于按分子量大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，在不同浓度的凝胶上，DNA片

段迁移的速度也不相同，凝胶浓度越大，凝胶的纤维网孔越密，越能有效地分离不同分子量的分子，尤其是分离小分子质量的分子。利用溴酚蓝染色

剂可以判断电泳迁移距离，电泳时间不能过长，否则迁移速度快的小分子量的DNA片段会跑到缓冲液中去。观察琼脂糖凝胶中的D

NA片段最简便的方法是利用荧光染料溴化乙锭（或其替代品GoldView）进行染色，溴化乙锭可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平

面基团，从而与DNA结合，并呈现荧光，显示出不同分子量的DNA带图谱，用已知大小的标准样品与未知片段的迁移距离相比较，就可以决

定未知DNA分子量大小。三、操作步骤（一）琼脂糖凝胶板的制备：1．琼脂糖凝胶的制备称取0.3g琼脂糖于

100mL烧杯中,加入30mLTBE缓冲溶液,在电炉上加热溶解，待完全融化后放置室温冷却至60℃左右。加入3μlGo

ldView，混匀。2．板的制备将上述冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入水平放置的制胶模具中，放上梳齿。待胶

凝固后取出梳齿，将胶板放入电泳槽中，胶面应浸没在TBE缓冲液液面以下2~3mm。将冷却至65℃的琼脂糖凝胶液小

心地倒进有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。在室温下静置lh，待凝固完全后，取下橡皮膏，将铺胶

的有机玻璃内槽放在电泳槽中，倒入TBE稀释缓冲溶液，直至浸

没过胶面2～3mm。双手轻轻地且用力均匀地拔出样品槽模板，在胶板上即

形成相互隔开的样品槽。（二）加样用微量加样器按下表配制样品与标准，混合后加样。孔1（泳道1）孔2（泳道2）

分子量标准（Marker）/μl50DNA样品/μl05点样液/μl01（三）电泳加完样品后的凝胶板立即通

电，于150v电压下电泳20~30min。在低电压条件下，线性DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，但是，在电场强度增加时，不同

分子量的DNA片段泳动速度的增加是有区别的，因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最

大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低

于0.5％时，由于胶太稀，最好在4℃下进行电泳，以增加凝胶硬度。（四）观察和拍照在波长为254nm的紫外灯下，观察染色

后的电泳凝胶。存在DNA的地方显示出红色的荧光条带。用紫外光激发30S左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护

眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光的损伤。拍照电泳图谱时，采用透射紫外光，照相机镜头加近摄接圈和红色滤光片（580

～600nm），距离50～60cm，采用全色胶卷，光圈为5.6，曝光时间10～20S，可根据荧光条带的深浅进行选择。将电泳图谱

放大为0.9cm×1.5cm的照片，用于相对分子质量的测定。以上步骤可以用凝胶自动成像仪处理代替。一、目的与要求掌

握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。复习巩固7200型分光光度计的操作，并了解其基本结构。二、实验原理蛋白质分子

中含有多个与双缩脲结构相似的酰胺键，也具有这一反应反应产

物在540nm处有最大光吸收颜色的深浅与蛋白质（或多肽）的浓度呈正

比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的种类无关因而，双缩脲反应可用测定蛋白质的含量。在一定的实验条件下，将未知浓度的

样品溶液与标准浓度蛋白质溶液同时与碱性硫酸铜反应，并于540nm处比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求出未知样品蛋白质的浓

度。标准浓度的蛋白质溶液可由结晶的牛血清清蛋白，卵清蛋白或酪蛋白粉配制。除-CONH-有此反应外,-CH2NH2，-C

ONH2,-CSNH2等基团亦有此反应，故应注意有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。三、操作方法（一）标准曲线的绘

制试剂管号空白管12345测定管蛋白质标准液（5mg/m L）/mL待测样品/mL双蒸水/mL双缩脲试剂/mL00.40.8 1.21.62.0121.61.20.8 0.401 4

444444摇匀，37℃

保温30min，在540nm处比色，测定吸光度值（二）样品蛋白质浓度的测定待测样品必须进行适当的稀释，使每毫

升中含有0.5mg左右的蛋白质，才能进行测定。该过程至少重复两次或平行测定两次。7200分光光度计的使用四

、结果处理固体样品中蛋白质含量＝m’×Vm/Vn×1/m×10-3×100%式中m′——由标准曲线查到的样品的蛋白质含量（

mg）Vn——用于显色的样品体积（ml）Vm——样品稀释后的体积（ml）m——样品的质量（g）说明：(1

)双缩脲测定蛋白质含量的方法操作简便迅速，不需要昂贵的仪器和试剂，适合一般实验室的要求，因而被广泛应用于生产和科研中。(2)作

为标准的蛋白质应当用凯式定氮法测定纯度，否则误差较大。(3)

该反应在常温下也可显色，于37度下30分钟后颜色趋于稳定。(4

)当肽中含有脯氨酸时，若糖类较多，则显色反应不好，测定值偏低。(5)双缩脲试剂还常用来检测蛋白质的水解是否完全。五、思考

题（1）对于作为标准的蛋白质应有何要求？（2）若何选择未知样品的用量？（3）如何操作和处理数据才能减小试验误差？（4）若

为液体样品，如何求其浓度？实验4油脂皂化与皂化值的测定一、目的与要求掌握皂化原理测定皂化值的方

法。二、原理脂肪的碱水解称为皂化作用；KOH有助于脂肪的水解，并与释放的脂肪酸中和，形成肥皂；中和1g脂肪完全水解

所释放的脂肪酸所需要的KOH毫克数即为皂化值；它的实践意义是：组成脂肪的脂肪酸碳链越长，每克脂肪水解所释放的脂肪酸越少，即皂化值

越小。也就是说皂化值与脂肪、脂肪酸的相对分子质量成反比。制皂工业中利用这一数值来确定皂化所需碱量。三、操作方法1.称样

在分析天平上准确称取两份质量为1g的油（或脂），置于250mL锥形瓶中。2.皂化在样品瓶和空白瓶（不加油或脂）

中各加0.5mol/LKOH乙醇溶液25mL，再加几个玻璃珠，装上回流管，在水浴上回流30min左右，至瓶内液体澄清并无油珠

为止。3.滴定皂化完毕后，冷却至室温，取下锥形瓶，分别加入1%的酚酞指示剂2～3滴，然后以0.5mol/L的HCl

滴定至终点，记录HCl用量。四、结果处理皂化值=式中VA—空白瓶盐酸用量（mL）；VB—样

品瓶盐酸用量（mL）；m—油脂的质量（g）。五、思考题1.上式中（VA-VB）的含义是什么?2.试列出由

皂化值计算油脂相对分子质量的公式。实验5温度对酶活性的影响一、目的与要求（1）了解温度对酶活性的影响

。（2）掌握试验温度对酶活性影响的原理及方法。二、原理酶的催化活性受温度的影响很大，温度对酶催化的反应有双重

效应，一方面，温度上可以使加快；另一方面，温度升高又可使酶因变性而失活。本实验以枯草杆菌α-淀粉酶和蔗糖酶为例，说明温

度

对酶活性的影响。三、操作方法（1）温度对α-淀粉酶活性的影响取3支试管，编号，各加入0.5％可溶性淀粉溶液3mL

，分别置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保温5min，各缓缓加入1mLα-淀粉酶稀释液（试管勿从水浴中取出）继续保温5min，取出

37℃水浴及沸水浴中试管置于冰水浴中冷却后，各加入碘—碘化钾溶液约1mL，比较各管颜色，并解释之。（2）温度对蔗糖酶活性的

影响取3支试管，编号，各加入2％蔗糖溶液3mL，分别置于冰水浴，37℃水浴及沸水浴中，保温5min后，各加入1mL蔗糖酶

液，继续保温10min，取出后各加入2mL本氏试剂，置于沸水浴中煮2min。比较各管颜色，并解释之。四、思考题（1）温度

对酶活性的影响的机理。（2）试验温度对酶活性影响的一般方法。（3）如果要定量测定温度对酶活性影响，实验方案如何设计？

实验6血红蛋白的凝胶过滤一、目的与要求学习并掌握凝胶过滤的基本操作技术、分离原理及其应用。二、

原理凝胶过滤(Gelfiltration)色谱，又称分子筛色谱(MolecularSievehromatogr

aphy)或排阻色谱(Exclusionhromatography)。凝胶过滤色谱所用的介质载体由具有一定孔径的多孔亲水性凝胶颗

粒组成。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，如图7所示，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为

全排出。较小的分子则容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱

下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为

外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V0

时，出现洗脱峰。图凝胶色谱原理图凝胶色谱

中洗脱的三种峰凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi，能全部透入

凝胶的那些小分子，当洗脱体积为Vo+Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱体积为Vo+Ve时，出现洗脱峰(图30-2)。

由于凝胶过滤具有设备简单、操作条件温和，分离效果好，重现性强、凝胶柱可反复使用等优点，所以被广泛地使用于蛋白质等大分子的分离

纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等操作中。三、操作方法1.凝胶溶胀取5gSephadexG-25，加200mL蒸

馏水充分溶胀(在室温下约需6h或在沸水浴中溶胀5h)。待溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。

生物化学实验武汉工业学院生物与制药工程学院任课教师：刘军闫达中曾万勇董国清

丁洪波实验目录实验1淀粉的测定—1％盐酸旋光法实验2甲醛滴定法测定氨基氮含量实验3蛋白质含量测定—双缩脲法实验

4油脂皂化与皂化值的测定实验5温度对酶活性的影响实验6血红蛋白的凝胶过滤实验7DNA的琼脂糖凝胶电泳实验8综合性

实验羧甲基纤维素酶活力及pH值对酶活力影响实验9PCR方法检测转基因农产品大豆、玉米实验1

淀粉的测定—1％盐酸旋光法一、目的与要求掌握旋光法测粗淀粉的基本原理;掌握旋光仪的使用方法。二、原

理在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。在一定的水解条件下，一种谷物淀粉具有一种特定的比旋光度。

因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。1、旋光仪从光源(1)射出的光线，通过聚光镜(3)、滤色镜(4)经起偏

镜(5)成为平面偏振光，在半波片(6)处产生三分视场。通过检偏镜(8)及物、目镜组(9)可以观察到如图所示的三种情况。转动检偏镜，

只有在零度时（仪器出厂前调整好）视场中三部分亮度一致（如下图）。?a.大于（或小于）零度的视场??b.零度视场

c.小于（或大于）零度视场2、使用方法(1)将仪器接于220V交流电源。开启电源开关，约5分钟后钠光灯发光正常，就

可开始工作。(2)检查仪器零位是否准确，即在仪器未放试管或放进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。如不一致，说明有零

位误差，应在测量读数中减去或加上该偏差值。或放松度盘盖背面四只螺钉，微微转动度盘盖校正之（只能校正0.5°左右的误差，严重的应送制

造厂检修）。三、操作方法1.样品制备称取粉碎过40目筛的（玉米）样品2.50g（精确至0.01g）放入100

mL锥形瓶中；沿器壁缓慢加入50mLl％的盐酸溶液，并轻轻摇动使全部样品润湿；将锥形瓶放入沸水浴中，预热3min，在沸水

中准确加热15min；立即取出，迅速冷却至室温。2．样品测定先加1mL30％的硫酸锌溶液，充分混匀；

再加入1mL亚铁氰化钾溶液，摇匀并全部转移至100mL容量瓶中，用少量蒸馏水将锥形瓶冲洗几次；若泡沫

过多，加几滴无水乙醇消泡；用蒸馏水定容至刻度；混匀后过滤，弃去初始滤液15mL，收集其余滤液充分混匀；

进行旋光测定。式中α—测得的旋光度；[α]—淀粉的比旋光度（见下表）

l—旋光管长度

（dm）；m—样品质量（g）四、结果处理说明：（1）实验中，沸水浴要备有足

量的水；要用定时钟准确记时。（2）提前打开旋光仪，使其进入稳定的工作状态。五、思考题样品加

盐酸处理时，煮沸时间少于或多于15min会对测定结果分别产生什么影响？实验2甲醛滴定法测定氨基氮含量 一、

目的与要求（1）掌握蛋白质氨基酸含量的甲醛滴定法测定原理。（2）熟悉滴定操作的要点。二、原理氨基酸

是两性电解质，在水溶液中有如下电离平衡：-NH3+是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定所释放的H+来测

量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右

移，促使-NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色范围内（pH9.0左右）。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化

钠溶液滴定。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品是多种氨基酸的混合物如蛋白水

解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。此法简便快捷，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值增加，滴定值不再

增加时，表示水解作用已完全。三、操作方法取3个25mL的锥形瓶，编号；向第1、2号瓶内各加入0.1mol/L的标准甘氨

酸溶液2mL和水5mL，混匀；向3号瓶内加入7mL水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2mL甲醛溶液再混匀；分别用0.1mol/L标准氢氧化钠的溶液滴定至溶液显微红色重复以上实验3次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值,用于计算甘氨酸氨基氮的回收率。取未知浓度的甘氨酸溶液2mL，依上述方法进行测定，平行三次，取平均值,用于计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。四、结果甘氨酸氨基氮的回收率：公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。2mL乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘以14.008即为加入理论量的毫克数。每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数:V1为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数V2为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。CNaOH为标准氢氧化钠溶液的浓度。五、思考题1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么?2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的-NH3+基上的H+，

不能用一般的酸碱指示剂？实验3蛋白质含量测定—双缩脲法