质粒DNA纯化不连续梯度的实验方法
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发布时间：1天前
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时间：8分钟前
本文详细描述了一种通过不连续梯度离心法纯化质粒DNA的实验方法。该方法利用不同浓度的CsCl溶液分层离心，加速了CsCl梯度的形成，使得离心时间缩短至6小时。以下是详细步骤：
首先，配制125g的CsCl溶液（pH8.0），使其密度达到1.47g/ml。接着，将8ml的氯化铯溶液加入到Beckman Quick-Seal离心管中，作为后续操作的准备。
对于质粒DNA溶液，如果必要，可使用TE(pH8.0)调整至3ml。随后，在质粒DNA溶液中加入8.4g的CsCl，并将溶液加热至30℃以加速溶解。需小心混匀溶液直至盐分完全溶解。
调整溶液重量至13.2g，并加入0.8ml的10mg/ml溴化乙锭溶液（用水溶解），快速混匀直至染料均匀分散。此时，溶液体积应约为7.5ml。操作时需注意：溴化乙锭为强诱变剂且具有中度毒性，进行时需佩戴手套，并将染料贮存于避光容器内，于室温保存。
使用Sorvall SS34转头（或等效设备）以8000rpm离心5分钟，以清除浮渣，该浮渣由水垢、溴化乙锭和细菌蛋白组成。
将巴期德吸管插入装有CsCl溶液的离心管中，小心地将步骤8中的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，确保样本层位于CsCl溶液之下。如果需要，可添加步骤1中配制的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml)至离心管满，并封口。
将封口的离心管放入Beckman Ti70.1或Sorvall65.13转头中，在20℃下以60000rpm速度离心6小时。
最后，回收闭环质粒DNA区带。此步骤完成后，即可得到纯化的质粒DNA，而溴化乙锭已被去除。
综上所述，该不连续梯度离心法纯化质粒DNA的实验步骤详细且高效，通过分层离心加速CsCl梯度形成，有效缩短离心时间至6小时，提高了实验效率。同时，该方法对去除溴化乙锭提供了安全的操作指南，确保了实验人员的安全。
扩展资料
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。
