慢病毒系列|如何巧妙利用病毒载体构建稳转株?快看过来!
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发布时间：2024-12-20 15:17
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时间：2024-12-20 16:37
基因表达是生物体内基因表达的调节控制，其在疾病研究领域至关重要，是所有生物学过程的基础。细胞水平上的目的基因导入，根据基因的时间长短，可分为瞬时转染和稳定转染。实验中多会选择稳转的方式构建稳定表达细胞株，以避免瞬时转染效率的差异以及传代过程中目的基因可能的丢失，确保实验结果的稳定性与准确性。
稳定细胞株的构建通过将特定基因或干扰特定基因的序列整合至宿主的基因组染色体中，实现目的序列的稳定表达或稳定干扰。常用慢病毒载体完成这一过程，因为慢病毒能够整合序列到宿主基因组。构建稳定株的步骤如下（以Saos-2细胞为例）：
1. 细胞铺板：将Saos-2细胞按30%汇合度接种到6孔板。
① Saos-2细胞配成2.0×105cells/mL细胞悬液，待铺板。
② 每孔铺2mL，即4×105cells/well，铺1个6孔板。
2. 感染慢病毒：细胞铺板后12-20h感染病毒。
① 病毒量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）
② 加polybrene：细胞样品中polybrene终浓度为5μg/mL。
③ 病毒感染12-20h后换培养基：弃去培养基，每孔加入2mL新鲜的培养基。
3. 稳定株筛选：72h以后，加入终浓度2μg/mL puromycin。每隔2-3d换一次终浓度2μg/mL puromycin新鲜培养基。
① 药物筛选约两周后，拍荧光照片。
② 稳定细胞株鉴定和冻存。
在构建稳定株的过程中，不同基因策略的选择至关重要。基因表达可在多个层面上进行，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的。基因的上调多指外源过表达和内源性激活（如CRISPRa）等策略。当目的基因序列较长，载体容量受限时，内源性激活方式可实现目的基因上调。而基因的下调则采用RNA干扰（RNAi）技术或基因敲除（如CRISPR/Cas9技术）进行，选择合适策略对实验结果至关重要。
通过慢病毒载体整合基因的能力，构建稳定表达的细胞株已成为科研领域中常见且有效的方法。和元生物提供包括过表达、干扰、CRISPR/Cas9、Cumate诱导表达系统、Tet-on/off系统、Cre-loxp系统等在内的多种慢病毒包装服务，适用于不同需求的科研项目。和元生物自主研发的Vpack慢病毒包装系统，能够全面满足在科学研究中对基因的需求，解决病毒不出毒和滴度低的问题，能保证lncRNA表达更精确，载体荧光表达更亮，病毒出毒更稳定。
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