干货|免疫组化(IHC),原来如此简单!
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发布时间：2025-01-02 19:38
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免疫组化，是应用免疫学原理，通过抗原抗体特异性结合的反应，使用化学方法使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，以定位、定性及相对定量研究组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的技术。此技术在光学显微镜或荧光显微镜下，可清晰显示出细胞内发生的抗原抗体反应产物，使得能在细胞爬片或组织切片上直接观察到化学成分的分布和含量。
免疫组化的分类基于标记物种类，包括免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等。每种方法依据其标记物特性及操作流程，具备不同的灵敏度和特异性。例如，免疫荧光法则通过已知抗体的荧光标记，检查细胞或组织中的相应抗原；免疫酶标法则利用酶标记的抗体，加入酶底物后生成有色产物，通过显微镜观察抗原位置。而免疫胶体金技术则利用胶体金颗粒标记抗体，因其高电子密度和不同大小颗粒特性，特别适用于免疫电镜的定位研究。
免疫组化方法分为直接法、间接法、抗原-抗体结合法、亲和连接法和聚合物链接法。直接法虽然操作简单，但灵敏度较低，多用于低丰度蛋白的检测。间接法通过增加信号放大步骤，显著提高检测灵敏度，但同时也增加了非特异性反应的可能性。抗原-抗体结合法如PAP法，通过在抗体上标记酶，实现信号放大，但非特异性较高。亲和连接法如ABC法和SP法，通过生物素和链霉亲和素的连接，提高了灵敏度和特异性。聚合物链接法如Polymer法，能成倍放大信号，但不适合定量实验。
免疫荧光法和LSAB法是免疫组化中常用的信号放大方法。免疫荧光法通过荧光标记的一抗直接检测抗原，而LSAB法则通过在二抗上标记生物素，进一步通过链霉亲和素标记的酶进行信号放大，提高了检测的灵敏度。然而，这种方法操作复杂，需要进行内源生物素封闭，增加了实验难度。Polymer法在二抗上标记聚合的HRP，提高了信号放大效率，但该方法在实验成本上较高。
免疫组化的关键步骤包括脱蜡、水化、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶和生物素、封闭、一抗和二抗孵育、SP反应、DAB显色、苏木素复染、脱水、透明和封片等。每一个步骤都对实验结果有着重要影响。例如，抗原修复过程通过改变抗原的表位暴露状态，提高检测的特异性；封闭步骤可以减少非特异性结合，提高实验结果的可靠性。
免疫组化实验中的异常分析主要包括非特异性染色和阴性结果。非特异性染色可能由抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、一抗使用多克隆抗体等因素引起。通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体、使用单克隆抗体等方法可以控制非特异性染色。此外，内源性过氧化物酶和生物素的高含量也可能增加背景染色，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。非特异性组分与抗体结合、DAB孵育时间过长或浓度过高等也可能导致非特异性染色。在实验过程中，确保充分的PBS冲洗和正确的封闭血清使用也是控制非特异性染色的关键。
免疫组化在临床应用中广泛，包括恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断、确定转移性恶性肿瘤的原发部位、对某类肿瘤进行进一步的病理分型。此外，免疫组化镜检能够定位抗体的表达部位，如细胞间质、细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核等或表达组织。免疫组化还用于细胞凋亡检测，通过检测凋亡细胞DNA片段进行染色，便于从形态学上分辨评估正常细胞和凋亡细胞。
