*CN102183472A*
(10)申请公布号 CN 102183472 A(43)申请公布日 2011.09.14
(12)发明专利申请
(21)申请号 201110008847.0(22)申请日 2011.01.11
(71)申请人山西大学
地址030006 山西省太原市小店区坞城路
92号(72)发明人阴彩霞 霍方俊 孙远强(74)专利代理机构山西五维专利事务所(有限
公司) 14105
代理人杨耀田(51)Int.Cl.
G01N 21/27(2006.01)G01N 21/64(2006.01)G01N 21/25(2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 2 页
(54)发明名称
一种检测汞离子的方法和试剂盒(57)摘要
本发明提供了一种检测汞离子的方法和试剂盒。本发明基于色烯衍生物和硫醇组成的分子探针，在HEPES缓冲溶液中定量地检测汞离子。检测汞离子的方法包括紫外光谱法、荧光光谱法和比色法；检测汞离子的试剂盒，包括装有10mM的HEPES缓冲溶液的试剂瓶、装有2mM的CPC乙醇溶液的试剂瓶、装有2mM的硫醇溶液的试剂瓶、比色管和标准色阶。本方法和试剂盒可应用于临床、环境、生物样品中汞离子的检测。检测过程简单，方便，易于普及推广。
CN 102183472 ACN 102183472 ACN 102183476 A
权 利 要 求 书
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1.一种检测汞离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，配制2mM的CPC乙醇溶液；
(2)、将2ml的HEPES缓冲溶液、25μl的CPC乙醇溶液和75μl的硫醇水溶液，依次加入到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，在227nm处有最大吸收峰；
(3)、取待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，最大吸收峰由227nm逐渐变为302nm，当302nm处达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
(4)、按75×2×10-5/V待测样计算出待测样中汞离子的含量。2.一种检测汞离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，配制2mM的CPC乙醇溶液；
(2)、将2ml的HEPES缓冲溶液、2.5μl的CPC乙醇溶液和7.5μl的硫醇水溶液，依次加入到干净的比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，在552nm处有弱的发射峰；
(3)、取待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，在552nm处的发射峰逐渐增加，当发射峰达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；
(4)、按7.5×2×10-5/V待测样计算出待测样中汞离子的含量。3.一种检测汞离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，标记为R1，配制2mM的CPC乙醇溶液，标记为R2，配制2mM的硫醇水溶液，标记为R3；
(2)、按照R1、R2、R3体积比为100∶1∶3，加入比色管中，此时溶液为无色；(3)、取R2体积1/5的待测样，用进样器加入到上述比色管中，摇振20-30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中汞离子的浓度；
所述的标准色阶，即从左到右的颜色依次为：无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的汞离子浓度为：0、5、15、30、50、75μM。
4.一种检测汞离子的试剂盒，包括试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、比色管、标准色阶；所述的试剂瓶1为装有100mL含0.5mM的EDTA、pH＝8.0浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，标记为试剂R1；
所述的试剂瓶2为装有5mL浓度为2mM的CPC乙醇溶液，标记为试剂R2；所述的试剂瓶3为装有5mL浓度为2mM的硫醇水溶液，标记为试剂R3；所述的标准色阶，即从左到右的颜色依次为：无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的汞离子浓度为：0、5、15、30、50、75μM。
5.如权利要求1、2或3所述的检测汞离子的方法，其特征在于，所述的HEPES缓冲溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液代替。
6.如权利要求1、2或3所述的检测汞离子的方法，其特征在于，所述的CPC用NPC或MPC代替；
CPC代表7-chloro-3，3a-dihydrocyclopenta[b]-chromen-1(2H)-one；NPC代表7-nitro-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chro-men-1(2H)-one；
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权 利 要 求 书
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MPC代表7-methoxy-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chro-men-1(2H)-one。
7.如权利要求1、2或3所述的检测汞离子的方法，其特征在于，所述的硫醇为半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
8.如权利要求4所述的检测汞离子的试剂盒，其特征在于，所述的HEPES缓冲溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液代替。
9.如权利要求4所述的检测汞离子的试剂盒，其特征在于，所述的CPC用NPC或MPC代替。
10.如权利要求4所述的检测汞离子的试剂盒，其特征在于，所述的硫醇为半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
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说 明 书
一种检测汞离子的方法和试剂盒
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技术领域
本发明涉及检测汞离子的方法和试剂盒，具体属于一种基于色烯和硫醇分子组成的汞离子探针定量检测汞离子的方法和检测汞离子的试剂盒。
[0001]
背景技术
重金属离子能对人体产生危害甚至致命的危险，特别是对于中枢神经系统，能够
引起神经紊乱。鉴于重金属离子的检测对人类具有重要意义，重金属离子的检测方法不仅受到化学家、生物学家和环境工作者的重视，还受到越来越多的人民大众的广泛关注。[0003] 虽然一些重金属离子在维持人体新陈代谢中起着重要的作用，但Hg2+、Pb2+、Cd2+、As3+等重金属离子对人体却是百害无一利，特别是汞离子。众所周知，汞是一种严重危害人体健康的重金属。煤矿、金矿的开采等人类活动和火山爆发、森林大火等自然活动都会造成汞离子的扩散。汞单质很容易通过蒸发扩散到大气中，能随气流穿越大陆和海洋，且容易被氧化为Hg2+，导致其在植物、土壤和水中的沉积。汞离子能够在海洋生物体内累积，通过食物链转移到人体内。汞离子沉积在脑、肝和其他器官中，产生慢性中毒，损害肾、脑胃和肠道，甚至引起死亡，最典型的例子就是在日本发生的水俣病。另外，汞元素及其化合物能够通过皮肤被吸收，引起口腔炎、齿龈炎和神经紊乱等疾病。汞离子对人体含有S原子的配合基显现出了很强的亲和力，能引起蛋白质、酶和膜的巯基(-SH)结块。汞中毒会对整个社会产生极其恶劣的影响，现在汞被优先列在全球环境监控系统(GEMS)清单上，全世界都花费大量的人力、物力和财力在开发和研究新型的检测汞离子方法。[0004] 目前检测重汞离子的技术主要有：原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子荧光分光光度分析法、电化学分析法、质谱法和毛细管电泳法等。然而这些方法需要复杂、耗时的程序、需要高级昂贵的仪器和具有高的检测限等缺陷。由于比色和荧光的光学探针具有高选择性、低检测限、低成本并易于操作的特点，受到越来越多的关注。但是，已报道的汞离子光学探针仍存在检测限高、水溶性差、检测过程使用有机溶剂易造成二次污染等缺点。因此，发展新型的水溶性好、检测限低的汞离子光学探针在科研、临床和环境检测中具有重要意义。
[0002]
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术汞离子检测中存在的问题，提供一种高选择性、高灵敏度、水溶性好的汞离子检测方法，并提供一种价格便宜、操作简单、检测过程迅速的试剂盒。
[0006] 本发明总的发明构思是基于色烯衍生物和硫醇组成的分子探针，在HEPES缓冲溶液中定量地检测汞离子。
[0007] 本发明涉及的色烯衍生物为：CPC，7-chloro-3，3a-dihydrocyclopenta[b]-chromen-1(2H)-one；NPC，7-nitro-3，3a-dihydrocyclopenta[b]chro-men-1(2H)-one；MPC，7-methoxy-3，3a-dihydrocyclopenta[b]-chromen-1(2H)-one。
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说 明 书
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本发明涉及的硫醇为：半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)或谷胱甘肽(GSH)。[0009] 本发明提供的一种检测汞离子的方法(紫外光谱法)，包括如下步骤：[0010] (1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，并配制2mM的CPC乙醇溶液；[0011] (2)、把2ml的HEPES缓冲溶液、25μl的CPC乙醇溶液和75μl的硫醇水溶液，依次加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，在227nm处有最大吸收峰；[0012] (3)、取待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，最大吸收峰由227nm逐渐变为302nm，当302nm处达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；[0013] (4)、按75×2×10-5/V待测样计算出待测样中汞离子的含量。[0014] 本发明提供的另一种检测汞离子的方法(荧光光谱法)，包括如下步骤：[0015] (1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；[0016] (2)、把2ml的HEPES缓冲溶液、2.5μl的CPC乙醇溶液和7.5μl的硫醇水溶液，依次加到干净的比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，在552nm处有弱的发射峰；[0017] (3)、取待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，在552nm处的发射峰逐渐增加，当发射峰达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为V待测样；[0018] (4)、按7.5×2×10-5/V待测样计算出待测样中汞离子的含量。[0019] 本发明提供的再一种检测汞离子的方法(比色法)，包括如下步骤：[0020] (1)、配制pH＝7.0-10.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，标记为R1，配制2mM的CPC乙醇溶液，标记为R2，配制2mM的硫醇水溶液，标记为R3；[0021] (2)、按照R1、R2、R3体积比为100∶1∶3，加入比色管中，此时溶液为无色；[0022] (3)、取R2体积1/5的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振20-30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中汞离子浓度范围。[0023] 试剂盒标准色阶的制定：在含有25μM的CPC、75μM的硫醇、pH＝8.0且浓度为10mM的HEPES缓冲溶液中，依次向六个比色管中分别加入汞离子溶液，使汞离子的浓度分别为0、5、15、30、50、75μM，得到标准色阶(见图4)，即：从左到右的颜色依次为，无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的汞离子浓度为：0、5、15、30、50、75μM。本发明提供的一种检测汞离子的试剂盒，包括试剂瓶1、试剂瓶2、试剂瓶3、比色管、标准色阶；
[0025] 所述的试剂瓶1为装有100mL含0.5mM的EDTA、pH＝8.0浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，标记为试剂R1。
[0026] 所述的试剂瓶2为装有5mL浓度为2mM的CPC乙醇溶液，标记为试剂R2。[0027] 所述的试剂瓶3为装有5mL浓度为2mM的硫醇水溶液，标记为试剂R3。[0028] 所述的标准色阶(见图4)，即：从左到右的颜色依次为，无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的汞离子浓度为：0、5、15、30、50、75μM。[0029] 试剂盒的使用方法(比色法)：[0030] (1)、按照R1、R2、R3体积比为100∶1∶3，加入比色管中，此时溶液为无色；
[0024]
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说 明 书
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(2)、取R3体积1/5的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振20-30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中汞离子浓度。
[0032] 所述的HEPES缓冲溶液可以用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液等代替。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：1、检测体系由色烯分子和硫醇组成，在纯水溶液中检测汞离子，避免了使用有机溶剂可能造成的环境污染；2、本发明的检测方法，对汞离子显示了极高的灵敏性和选择性，其它金属离子和体液中的各种阴离子不干扰检测结果；3、检测过程简便、灵敏、快速，有很低的检测限和宽的线性范围，检测结果准确；4、检测手段简单，易于推广，既可以与紫外分光光度计、荧光分光光度计配套使用，也可以不借助任何机器，目视比色检测，适合医疗卫生、环境检测和科学研究领域，有很广的应用范围。
附图说明：[0034] 图1：在含有25μM CPC、75μM硫醇和pH8.0HEPES(10mM)缓冲溶液中逐渐加入汞离子的紫外可见吸收图。[0035] 图2：在含有25μM MPC、75μM硫醇和pH8.0HEPES(10mM)缓冲溶液中逐渐加入汞离子的荧光光谱图。[0036] 图3：在含有25μM CPC、75μM硫醇和pH8.0HEPES(10mM)缓冲溶液中加入各种金属离子的紫外可见吸收图。[0037] 图4：本发明试剂盒标准色阶图。[0038] 图5：比色法检测待测样中汞离子浓度的颜色图具体实施方式：[0039] 实施例1：检测汞离子的方法(紫外光谱法)[0040] (1)、配制pH＝8.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液；[0041] (2)、把2ml的HEPES缓冲溶液、25μl的CPC乙醇溶液和75μl的硫醇水溶液，依此加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，在227nm处有最大吸收峰；[0042] (3)、取待检测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，最大吸收峰由227nm逐渐变为302nm，当302nm处达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为75μl；[0043] (4)、按75×2×10-5/75计算出待测样中汞离子的含量为20μM。[0044] 实施例2：检测汞离子的方法(荧光光谱法)[0045] (1)、配制pH＝8.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇溶液，并用乙醇配制2mM的MPC乙醇溶液；[0046] (2)、把2ml的HEPES缓冲溶液、2.5μl的MPC乙醇溶液和7.5μl的硫醇水溶液，依此加到干净的比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，在552nm处有弱的发射峰；[0047] (3)、取待检测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，在552nm处的发射峰逐渐增，当发射峰达到最大值时，停止
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加待测样，此时加入待测样的体积计为2.5μl；[0048] (4)、按7.5×2×10-5/2.5计算出待测样中汞离子的含量60μM。[0049] 实施例3：其它金属离子不干扰[0050] (1)、配制pH＝8.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为1-100mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的硫醇水溶液，并用乙醇配制2mM的CPC乙醇溶液，；[0051] (2)、把2ml的HEPES缓冲溶液、25μl的CPC乙醇溶液和75μl的硫醇水溶液，依此加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，在227nm处有最大吸收峰；[0052] (3)、取氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化钡、氯化铬、氯化锰、氯化铁、氯化钴、醋酸镍、氯化铜、氯化锌、氯化铝、硝酸银、硝酸铅、氯化镱溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，光谱上无明显变化；[0053] 实施例4：检测汞离子的方法(比色法)[0054] (1)、配制pH＝8.0、含EDTA浓度为0.5mM、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，标记为R1，配制2mM的CPC乙醇溶液，标记为R2，配制2mM的Cys水溶液，标记为R3；[0055] (2)、按照R1、R2、R3体积分别为2000μl∶20ul∶60ul，加入比色管中，此时溶液为无色；
[0056] (3)、取12ul的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中汞离子浓度在30-50μM之间，约为38μM。[0057] 试剂盒标准色阶的制定：在含有25μM的CPC、75μM的Cys、pH＝8.0且浓度为10mM的HEPES缓冲溶液中，依此向六个比色管中分别加入汞离子溶液，使汞离子的浓度分别为0、5、15、30、50、75μM，得到标准的色阶图(见图4)，即：从左到右的颜色依次为，无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的汞离子浓度为：0、5、15、30、50、75μM。
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说 明 书 附 图
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图1
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说 明 书 附 图
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