实验五 植物组织中SOD活性测定

一、实验目的

学习并掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理和操作方法。 二、实验原理

超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。测定SOD活性的方法很多，简便且常用的是NBT(氮蓝四唑)光还原法。该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。当反应体系中有可被氧化的物质存在时，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气，氧气被单电子还原产生氧自由基，氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。因此可通过测定A560来计算SOD的活性，以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。 三、实验材料、试剂与仪器 1. 实验材料：小白菜叶片。 2. 实验试剂：

（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；

（3）750μmol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；

（4） 100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（5）20μmol/L 核黄素溶液：100μmol/L 核黄素溶液稀释5倍即实验所需的20μmol/L 核黄素溶液；

（6）SOD提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、 3. 实验仪器：

高速台式离心机，可见分光光度计，光照培养箱，专用试管，研钵等。 四、实验步骤 1、 粗酶液提取

将小白菜叶片放置在冰箱中冷处理3min，用作胁迫对照。分别取正常条件

和冷害处理的小白菜叶片（去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液定容至10ml。取5ml于1000rpm下离心10min，上清液即为SOD粗提液。 2、显色反应

取透明度好，质地相同的专用试管4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入反应显色试剂。

反应试剂（ml） 0.05mol/磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2 20μmol/L 核黄素溶液

粗酶液（ml） 蒸馏水(ml)

试管号

1 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.5

2 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.5

3 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0 0.5

4(黑暗对照)

1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0 0.5

注：1表示正常调节的小白菜；2表示冷处理的小白菜；3表示光下空白对照；4表示暗处理对照

4号试管加入核黄素之后立即用黑色布套套住遮光，全部试剂加完后摇匀，将试管置于光照培养箱中（使试管尽量靠近灯管），反应温度控制在30℃。反应结束后，用暗中对照管调零，3号管为光下对照，在560nm下测定1~3号试管反应液的吸光度，记录测定数据。 3、结果计算

SOD活性（U/g.FW.h-1）=(A0-AS) × Vt× 60/ (A0×0.5×FW×VS×t) 式中：

A0：光下对照管吸光度； AS：样品测定管吸光度； Vt：样品提取液总体积； VS：测定时样品用量（ml）； t：反应时间； FW：样品鲜重（g）

五、实验结果：

表1 不同材料的A412值 试管号 1 OD值 2 3

1 0.03 0.032 0.032 2 0.035 0.034 0.035 3 0.243 0.244 0.244 注：1表示正常条件的小白菜植株；2表示冷处理5min的小白菜植株；3表示光下对照

结果计算：

表2 不同材料组织SOD活性 A0 AS Vt/ml VS/ml t/min FW/g SOD活性（U/g.FW.h-1） 1 0.2437 0.0316 10 2 30 0.5 630.12 2 0.2437 0.0346 10 2 30 0.5 621.2 注：1表示正常条件的小白菜植株；2表示冷处理5min的小白菜植株；

正常条件下生长的小白菜植株SOD的活性为630.12 U/g.FW.h-1；冷处理3min后的小白菜植株SOD活性为621.2U/g.FW.h-1。 六、实验讨论

实验结果显示正常条件下生长的小白菜的SOD活性与冷处理条件下的小白菜SOD活性没有明显差异，甚至前者高于后者。其可能的原因是冷处理的时间不够，冷害对植物体的影响不足以激活SOD，致使植物体内的活性氧数量没有提高。另外，实验没有设置重复也是实验结果不佳的因素之一。