蛋白表达的Western Blot检测

实验13 蛋白表达的Western Blot检测 实验目的：

使学生掌握Western Blot印迹法检测蛋白质的实验技术。

实验原理：

蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体（antibody）结合的待检蛋白质（抗原，antigen），将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜或聚偏二氟乙烯 [poly(vinylidene difluoride)，PVDF）]膜上，此过程称为转印（blotting），以便随后的免疫学检测。转印后，将NC膜或PVDF膜与抗血清（含特异性抗体，即第一抗体）一起孵育，使第一抗体与待检蛋白结合，再用酶标第二抗体孵育膜，使第二抗体与第一抗体结合反应。最后用酶的显色底物或发光底物显示靶蛋白条带（图13-1、2、4）。

com w生物ww .ebioe.图13-1 Western Blots实验操作流程 图13-2 Western Blot的主要步骤

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蛋白质印迹法中将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶（图13-3、8）。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质（10％～20％）。电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上（图13-4、9）。

com w生物ww .ebioe.图13-3 虹吸（毛细）转印

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图13-4 电转印及检测

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w生物ww .ebioe.图13-5 化学显色法

目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体，可以直接购买作为标记的二抗。最常用的一种是酶(enzyme)连二抗。印迹膜用酶连二抗处理后，再用适当的底物（substrate）溶液处理，当酶分解底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置，对其进行定性定量分析（图13-5）。

在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）或辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）。碱性磷酸酶常用无色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）。反应中，碱性磷酸酶催化BCIP除去磷酸根基团，生成的5-溴-4-氯-3-吲哚的羟化物；该羟化物二聚化形成不溶性的蓝色化合物，即5,5′-溴-4,4′-二氯吲哚。在二聚化过程中产生的两个还原当量会将一个分子的氮蓝四唑（Nitro blue tetrazolium，NBT）还原为不溶性浓紫色染料（diformazan）。BCIP/NBT是适用于碱性磷酸酶交联物的发色检测最灵敏的指示系统。碱性磷酸酶的化学发光检测系统常用1,2-二氧杂环丁烷AMPPD（adamantyl 1,2-dioxetane phosphate）、AMPPD的卤素取代的衍生物CSPD®（Roche）以及CDP-Satr (第三代1,2-二氧杂环丁烷底物)。

辣根过氧化物酶常用生色底物有AEC、DAB、TMB等。3,3-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物为不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物。辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-4-乙基咔唑（3-amino-4-ethylcarbazole，AEC）氧化成褐色产物或将4-氯-1-萘酚（4-Chloro-1-naphthol， 4C1N）氧化成紫色产物。四甲基联苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）是过氧化物酶的生色底物，在过氧化物酶的催化下，电子供体TMB底物在过氧化氢氧化下失去电子，在pH4.9条件下，产生游离自由阳离子单电子氧化产物，呈现出颜色变化和沉积，形成蓝黑色沉淀产物，且不受乙醇影响。被用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高（可达0.15纳克），特异性好。

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另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法（enhanced chemiluminecence，ECL），辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）生成邻苯二甲胺（3-aminophthalate）的激发态。当激发态复合物返回基态时，将放出428nm的蓝光。在化学增强剂对碘苯酚（p-iodophenol）存在下，光强度可以增大1000倍，并持久达几个小时。通过将印迹放在照相底片（如X光片）上感光，再显影和定影，就可

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以检测辣根过氧化物酶的存在（图13-6）。

近年来逐渐出现了荧光Western Blot检测技术（如Li-Cor Odyssey系统），即用荧光（如Alexa680、IRDye800）标记二抗，进行Western Blot的检测（图13-12、13）。Li-Cor Odyssey系统不但可以在常规固相膜上进行荧光成像，还可以直接在凝胶上进行成像，即in-gel Western Blot；甚至直接在细胞水平成像，即in-cell Western Blot。

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图13-6 化学发光法（chemiluminescence）

实验材料：

[1]. 转印缓冲液：同5×SDS电泳缓冲液，不含SDS，如果采用PVDF膜或NC膜加

20%甲醇，不加甲醇也可以。

[2]. 5×转印缓冲液：15g Tris、72g甘氨酸溶解在蒸馏水中，再加水定容到1000ml。

一般不需调节pH值，用时稀释5倍到1×转印缓冲液。

[3]. 10×丽春红储存液：0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸，加入H2O定容至100ml。临

用前稀释10倍为应用液。 [4]. PBS（0.01M 磷酸盐缓冲液）：137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4•7H2O,

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w生物ww .ebioe.图13-7 荧光法

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[5]. [6].

[7].

[11]. [12]. [13]. [14]. [15].

实验步骤：

1、蛋白质的SDS-PAGE电泳

同实验12。

2、SDS-PAGE的电印迹

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。

蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。

2.1、半干式转印

[1]. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。

取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注

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w生物ww .ebioe.[8]. [9]. [10].

1.4mM KH2PO4。 配制10×贮存液：称取80g NaCl、2g KCl、11.5g Na2HPO4•7H2O、2g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。高压下蒸气灭菌，保存存于室温或4℃冰箱中。用时用灭菌是稀释到1×。 需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na+ 或K+的浓度，Na+ 和K+只是用来调节渗透压的。

漂洗液(TBS-T)：0.01M TBS-T。 配制：1.21g Tris和5.84g NaCl溶解在800ml H2O

中，用HCl调节pH到7.5，加入0.05%或0.1%Tween-20, 用H2O定溶至1000ml。

封闭液：含5% BSA的TBS-T或含5%脱脂奶粉的PBS-T或TBS-T。临用时取200ml PBS-T或TBS-T加入10g脱脂奶粉即为封闭液。

注意：若使用碱性磷酸酶系统检测，不能采用此封闭液，因其中一般富含碱性磷酸酶。碱性磷酸酶系统最好的封闭剂是含6%酪蛋白、1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVP）和10mM EDTA的磷酸缓冲盐溶液。该封闭液须经65℃加热1小时失活残留的碱性磷酸酶，然后加入3mM叠氮钠保存于4℃。 第一抗体（Ab1）：抗小鼠 GAPDH抗体

注意：抗小鼠 GAPDH抗体最好挑选在Western Blot、ELISA及IHC（免疫组织化学）分析中都可以使用的多用途抗体；这样，该抗体就可以同样用于其他实验，如实验14的ELISA检测、实验34的免疫组化检测。 第二抗体（标记的Ab2）：HRP标记的羊抗鼠（Goat-anti-mouse）抗体 0.5M Tris-HCl (pH7.6)：

HRP底物以及显色指示剂： DAB溶液。 配制：称30mg DAB，用100ml 0.5M Tris-HCl (pH7.6)溶解，如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制。用前加入1% H2O2 1~1.5ml (0.01%), 混匀后使用。 抗体稀释液：TBS-T

显影液：750ml H2O，3g米土尔，100g水亚硫酸钠，3g苯二酚，3g溴化钾，无水碳酸钠：先加5g，不够时再加5g；注：以上配定加H2O定容至1000ml。

240g硫代硫酸钠，25g无水亚硫酸钠，48ml定影液：起始水温：60℃ 700ml H2O，

冰醋酸。注：加H2O至1000ml。

转移电泳槽和转移电泳仪(电源) ，震荡器，冰箱，滤纸 暗室

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[2]. [3].

[4]. [5].

满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开，边推边进，反复多次注水，直至凝胶从玻璃板上滑落下来。 将NC膜或PVDF膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5~10min。 按照图13-8放置转引装置，由下往上的次序为 “3层滤纸→凝胶→NC膜或PVDF膜→3层滤纸→吸水纸”。将“3层滤纸→凝胶→NC膜或PVDF膜→3层滤纸”搁置好之后，应用玻璃棒在滤纸上稍用力滚动，以除去各层间可能夹带的气泡。 将上面的转印装置放到半干槽中。

将胶下转印纸（或滤纸）两端搭进转印液中。转引装置顶部覆盖一玻璃板，玻璃板上再放一重物。转印过夜。

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2.2、湿式电转印

[1]. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。

取出凝胶方法同半干式电转印。

[2]. 将NC膜或PVDF膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5~10min。 [3]. 将凝胶推到一张玻璃板（或投影胶片）上，在凝胶上放3层滤纸，用玻璃棒在

滤纸上稍用力滚动，以除去各层间可能夹带的气泡。再在滤纸上盖一张投影胶片或玻璃板上，形成“玻璃板→凝胶→滤纸→玻璃板”装置。用手捏住上下玻璃板，将整个装置反转后放在桌面上。小心移去上面的玻璃板，在凝胶上覆盖PVDF膜，再在PVDF膜上覆盖3层滤纸，形成“3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸”的装置。用玻璃棒在滤纸上稍用力滚动，以除去各层间可能夹带的气泡。将上面的装置夹在两块转印海面垫间，再夹入电转印夹。 [4]. 将电转印夹插入转印电极板间，方向为。“负极→海面垫→3层滤纸→凝胶→

PVDF膜→3层滤纸→海面垫→正极”（图13-9）。

[5]. 将转印电极板插入电泳槽，加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱

内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

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w生物ww .ebioe. 图13-8 毛细管印迹法装置

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图13-9 电泳印迹法装置

3、印迹膜上总蛋白的染色

在确定印迹中是否存在总蛋白之前,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况，并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功，同时，该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性。

丽春红S印迹膜染色法：

丽春红S适用于酸性水溶液，染色但是不持久，在后续的处理中红色染料易被洗去，由于与蛋白质的结合是可逆性的，该染色方法适用于所有显示抗原的技术。丽春红S带负电荷，可以与带正电贺的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色条带。

丽春红染色剂（Ponceau S）是一种水溶性的阴离子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸（diazotized 4-amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid； Acid Yellow 9）和萘酚二磺酸（2-naphthol- 3,6-disulfonic acid；R acid）耦合到四钠盐上。其分子式C22H12N4Na4O13S4，分子量为760.6。最大吸收光谱为520nm波长。带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。

[1]. 转印结束后取出印迹膜至于丽春红S应用液中，并在室温下搅动5~10min； [2]. 将膜放入PBS洗数次，每次1~2min，并且更换PBS；

[3]. 根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记；至此膜可以用于封闭和加入

抗体。 4、膜的封闭

在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2% Tween-20，20% BSA，10% 马血清以及5% 脱脂奶粉（No-fat milk）等。至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异

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着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5% N-fat milk。

封闭过程：

[1]. 洗膜：室温漂洗3次×10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗

体结合。

[2]. 封闭：取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭

2h，也可在4℃过夜。

[3]. 漂洗：用1×TBS-T，pH7.6洗液，室温漂洗3×10min。 5、抗体杂交

抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素、酶（AP、HRP），以及生物素（Biotin）等。 杂交过程：

[1]. 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液（TBS-T）稀释的Ab1浓度为

1μg/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22~25℃）摇动孵育2h； [2]. 液洗膜3×10min；

[3]. 标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1h，洗膜3×10min。 6、检测

根据标记Ab2的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同，较常用的检测系统有HRP标记 Ab2的增强化学发光(ECL)和DAB检测系统。

6.1、辣根过氧化物酶-DAB法:

[1]. 新鲜配制DAB溶液：称30mg DAB，用100ml 0.5M Tris-HCl (pH7.6)溶解，如有

沉淀，过滤后使用。

[2]. 新鲜配制的DAB溶液用前加入1% H2O2 1~1.5ml (0.01%), 混匀。 [3]. 将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上，室温放置观察，可出现明显

的棕褐色蛋白显色带。

[4]. 终止：用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应。 6.2、辣根过氧化物酶-ECL法:

增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理,将结果记录下来：

[1]. ECL显色剂配制：按1ml H2O加显色剂A、B各1滴，混匀。

[2]. 在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，约1~5min。 [3]. 用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚

平，并确定干的表面与胶片接触。

[4]. 将印迹膜在暗室中使胶片暴光1~5min，冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时

间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时。

[5]. 冲洗胶片步骤：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，在放

入定影液中漂洗，10秒即可。

注意事项：

[1]. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此，凝胶电泳时的蛋白上样量应该保

证被检测抗原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释，上样电泳后，直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量，纯化和浓

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缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高，可平衡一下盐的浓度，如透析。

[2]. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度，激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合

的速度，也将影响凝胶的质量，聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此，建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15~20min最佳，对于浓缩胶最佳聚合时间为8~10min开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。

[3]. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，

应确保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心，不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。

[4]. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，

同时建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10~20V，20~30min)

[5]. 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。 [6]. 为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。

[7]. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数天，但是反复冻融会使蛋白质降解。 [8]. 为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者

转印。

[9]. 上样时，小心不要使样品溢出而污染相邻加样孔。

[10]. 取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记（如左上角）

转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记（如左上角）以分清正反面和上下关系。

[11]. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极，即凝胶对应负极，NC膜对应正

极。

[12]. 一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交。 如前次杂交结果条带距离本次

杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBS-T洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始。 如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用 strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30~60min，然后用PBS-T洗涤10min×3次，再从封闭开始。 对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

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图13-10 考玛斯亮蓝染色的凝胶（A）和Western Blot检测结果（B） (From: http://www.viswagenbiotech.com/images/sds_western_blot_proprep.jpg)

w生物ww .ebioe.易图13-11 化学发光法western blot检测结果示例[Western Blot Using LumiGLO (KPL)] E. coli crude cell lysate overexpressing B-Gal detected using a rabbit anti B-Gal primary antibody and the Protein Detector LumiGLO Western Blot Kit with HRP anti-rabbit conjugate, 10 minute

film exposure.

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图13-12 荧光法western blot检测结果示例一

(From: http://www.genscript.com)

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图13-13 荧光法western blot检测结果示例二 (From: http://www.licor.com)