家畜生态学报
ActaEcoloiaeAnimalisDomasticig
Vol．４０No．６
Jun．２０１９
子宫内膜中TLR４的定位及pcDNA３．１ＧTLR４载体的构建
()石河子大学动物科技学院,新疆石河子８新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,新疆石河子８１．３２０００;２．３２０００
２
,孔维欢１,代 蓉２,万鹏程２∗,石国庆２∗
[()摘 要]蛋白在子宫内膜组织中具体的分布与表 试验旨在研究TLR４Tolllikerecetor４p、、、、)选择早期妊娠绵羊(子宫组织,采用免疫组织化学和细胞免疫学抗体９d１３d１７d２１d２５d着色法检测各阶段子宫组织中T确定受体蛋白的表达部位.同时将LR４蛋白的分布与表达,构建的p检测TcDNA３．１ＧTLR４质粒转染到确定的受体细胞,LR４蛋白的表达水平.结果表明:呈一定的动态时空模式,且第１TLR４蛋白在子宫内膜各部位均有表达,７d胚胎附植后主要表达于内膜基质细胞;重组质粒转染到基质细胞后,TLR４蛋白的表达水平明显增强.此研究成功构建p为TcDNA３．１ＧTLR４表达载体,LR４在生殖细胞免疫学功能的研究奠定了一定的理论基础.
[关键词]子宫内膜;免疫组织化学;载体构建 TLR４;cDNA３．１ＧTLR４;p
:/doi１０．３９６９．issn．１６７３Ｇ１１８２．２０１９．０６．００４j
[中图分类号]文献标识码] S８１１．５ [ A
达,从而构建T为TLR４真核表达载体,LR４在细胞水平上的功能研究提供一种技术手段.
[()文章编号] １００５Ｇ５２２８２０１９０６Ｇ００１９Ｇ０７
()是最早发现于人类 TLR４Tolllikerecetor４p
细胞表面的一种与果蝇Toll蛋白同源的Toll样受
[]１]
,体蛋白[也是继NussleinＧVolhard等２研究的决
定果蝇胚胎背、腹侧分化发育有关的Toll基因受体
最后进入细胞核调kB、APＧ１或IRFＧ３等转录因子,
节炎症因子、细胞因子、共刺激分子和细胞增殖、凋亡等基因的表达,从而启动先天性免疫和获得性免
]６
.疫系统[
家族的成员之一,属于Ⅰ型跨膜蛋白受体,可特异性
３]
.T的识别对应的病原相关分子模式[LR４由胞外
还与肿瘤癌TLR４不仅有着天然的免疫反应,
症发生机制和胚胎发育、妊娠疾病等方面有着直接或间接的关系,并发挥着不同程度的作用.TLR４作为胚胎发育候选基因,在早期胚胎发育过程当中扮演重要的角色.研究发,现TLR４在肿瘤细胞的
７Ｇ１０]
.而肿迁移与浸润、增殖与凋亡有密切的关系[
区、跨膜区和胞质区３部分构成,其中胞外含有１５,可与C~２９个亮氨酸重复序列(LRR)D１４分子中
的亮氨酸重复序列结合而介导蛋白质之间的相互作用.胞内由一段与ILＧ１受体胞内区的保守序列具并且TIR含有的３个高度保守区能够在TLRs和
]４
.不信号传导衔接蛋白的蛋白质中发挥重要作用[
[]
有高度同源性的TIR结构域和跨膜结构域构成１,
瘤的侵袭过程与胚胎的附植过程有很大的相似性.本试验继前期TLR４在附植前期子宫组织中
呈特异性动态时空模式表达的基础上,进一步通过免疫组织化学、载体构建、细胞转染等技术,来发现从而TLR４蛋白在子宫内膜中具体的分布与表达,构建T为TLR４真核表达载体,LR４在细胞水平上的功能研究提供一种思路.
同的TLRs可使用不同的衔接蛋白来确定下游的信号传导通路,而TLR４具有MD８８依赖型和非依y
[]
赖型/TRIF依赖型信号转导通路５.两条信号转
导通路都可以经过一系列的信号传导链激活NFＧ
收稿日期] [ ２０１８Ｇ０４Ｇ１４修改日期:２０１８Ｇ０５Ｇ１４
););基金项目]兵团科技攻关与成果转化计划项目(国家绒毛用羊产业技术体系 [ 国家重点研发计划项目(２０１７YFD０５０１９０４２０１６AC０２７
()CARSＧ３９Ｇ０７
,:作者简介]男,河南濮阳人,硕士研究生,研究方向:动物遗传育种与繁殖.E [ 孔维欢(１９８９－)Ｇmail９１９２８２６３２＠q．comq
[](),,,,,:.通讯作者石国庆男新疆石河子人研究员博士生导师研究方向绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究∗ １９５９－
:EＧmailnkkxxms＠１６３．com;y
,万鹏程(男,新疆石河子人,研究员,硕士生导师,研究方向:绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究.１９７７－)
:EＧmailenchen．wan＠gmail．compgg
２０
家畜生态学报
].献[１４
第４０卷
１ 材料与方法
１．１ 试验材料１．１．１ 材料来源 前期试验置于４％多聚甲醛溶)的子宫组织及分离冻存的子宫组织及内膜基２５d
质细胞.
水１．２．２ TLR４受体在内膜组织中的定位 脱蜡、
化、抗原修复、封闭、抗体孵育、显色与复染及酒精脱
１２]水、封片镜检等具体操作参考熊燊源等[方法.
、、、、液中固定的胚胎附植前期(第９d１３d１７d２１d
１．２．３ 内膜基质细胞的免疫化学鉴定 １．２．３．１ 细胞的传代培养 取本实验室保存的基/,质细胞进行解冻复苏;弃上１０００rmin离心５min清,将细胞悬浮于新鲜培养液中置于培养皿;５％液,加入１~２mPBS洗涤两遍,L胰酶消化１~３的细胞液分装至２~３个新的培养瓶中,补充培养液,置于培养箱中培养.
１．２．３．２ 固定 当观察到细胞铺满培养瓶底部约
弃培养液加P加入８０％~９０％时,BS洗涤２~３次,定量４％多聚甲醛进行固定.３０min后为去除内源性过氧化物酶,再加入适量３％H２O２进行细胞覆１．２．３．３ 孵育 加５％非特异性正常山羊血清封
闭３滴加M０min左右后,ouseantiＧvimentin一抗置于４℃冰箱过夜孵育,PBS清洗３次.然后再滴,加p再用vＧ６００２放在３７℃恒温箱里孵育２０minPBS清洗３次.最后使用现配的DAB试剂进行显色拍照.
１．２．４ 引物的设计与合成 根据Genbank中绵羊TLR４基因的cDNA全长序列(NM_００１１３５９３０．),应用软件P１rimer５．０进行酶切位点的分析及引
,物设计(见表１)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.
盖,然后用PBS清洗２次.
CO３７℃的CO２４h使细胞单２、２培养箱进行培养,
层贴壁铺于培养皿中;将过夜培养的细胞弃掉培养,至贴壁细胞有“似落非落”现象,加入２~４mminL培养液混匀吹打,使贴壁的细胞完全脱落.将悬浮
１．１．２ 主要试剂 RabbitantiＧTLR４抗体、Mouse
ctokeratinantiＧ１８抗体、MouseantiＧvimentin抗体y
(,Bioss公司)GoatantiＧrabbitIG(H&L)ＧHRP(,质粒(实验室保Bioword公司)cDNA３．１(＋)p
R,存)大连宝生PrimeSTAR○HSDNA聚合酶(
,,物)琼脂糖(Biowest公司)Trizol试剂(Invitroeng
、T４连接酶、HindIIIXhoI内切酶(TaKaRa公,),司)氨苄青霉DH５α大肠杆菌(TransGenBiotech、展片槽１．１．３ 主要仪器 切片机(RM２２３５)()、、包埋机(、烘片机(染HI１２１０HI１２２０)EG１１３０),公司.倒置显微镜(电子分析天平Nikon公司))细胞培养皿(等.NUNC,Denmark)(素(北京索莱宝)等.Amp
,,公司)反转录试剂盒(北京全式金公司)高保真酶、
)、)片机(自动封片机(均购至LCV５０３０CV５０３０eica
(,,紫外分光光度计(Denver公司)BioＧRad公司)
,各种UV凝胶成像系统(UvitecCambride公司)g１．１．４ 主要溶液配制 １×PBS溶液、４％多聚甲
醛、苏木精染液、LB液体培养基、LB固体培养基、１．２ 试验方法
脱水洗涤、透１．２．１ 组织切片的制作 固定组织、明处理、透蜡包埋、切片制备等具体操作方法参考文细胞培养液及细胞转LB＋Amp液体/固体培养基、
].染液等,配制方法参考文献[１１
GAPDHTLR４
基因Gene
１．２．５ 绵羊TLR４基因cDNA全长序列的扩增
以提取转录的绵羊子宫组织c进行DNA为模板,.产物进行凝胶最后７３５个循环;２℃延伸１０min电泳的检测分析,之后４℃保存.的扩增保存 质粒１．２．６ 质粒pcDNA３．１(＋)
F:５′ＧAGTCCACTGGGGTCTTCACTＧ３′
R:５′ＧTCACAAACATGGGAGCGTCAＧ３′F:５′ＧCCCAAGCTTATGGCGCGTGCCCGCCGGGCＧ３′R:５′ＧCCGCTCGAGTCAGGTGGAGGTGGTCGCTＧ３′
))引物序列(５＇➝３＇Primerseuence(５＇➝３＇q
Table１ RTＧPCRprimerseuenceq
表１ RTＧPCR的引物序列
/片段大小Framentsizebgp
１４９２５２３
PCR扩增,５０μ扩增体系见表２.其反应条件为:,,,共９５℃５min;９５℃３０s６０℃３０s７２℃１min
(在真核表达载体的构建中有着广泛cDNA３．１＋)p
的应用,且带有N表达含有Ameomcin启动子,yp抗性基因和多个克隆酶切位点,其中就包含试验所需的HindIII和XhoI位点.
(将含有p质粒的DHcDNA３．１＋)５α菌液接种到培养基,置于３７℃恒温箱过夜培养之后进行
Amp抗性筛选.
第６期 孔维欢,等:子宫内膜中TLR４的定位及pcDNA３．１ＧTLR４载体的构建
Table２ PCRamlificationsstempy
５×PSBufferdNTP
上游引物Forwardprimer下游引物Rearprimer
R○PrimeSTAR高保真酶R
PrimeSTAR○hihfidelitnzmegyey
成分Comonentp
表２ PCR扩增体系
２１
/体积VolumeLμ
１０．０
４．０２．０２．０
１．２．１０ 菌落PCR鉴定及重组质粒的双酶切鉴定
反应体系见表 挑取单菌落进行菌落PCR鉴定(.鉴定为阳性的P扩增程序参照１．５,２．５)CR菌落
接种到含Am收集菌液B液体培养基中培养,p的L.重组质粒命提取重组质粒进行双酶切鉴定(表６)名为pcDNA３．１ＧTLR４.
Table５ ColonCRreactionsstemyPy
(、)MixdNTP、Bufferenzmey成分Comonentp
表５ 菌落PCR反应体系
cDNA模板cDNAtemlatepddH２O
０．５１．０
５０．０
/体积VolumeLμ
１０．０ 质粒的提取:参照小提试剂盒说明书提取TI行质粒的检测和纯化,保存在pAcDNNGEN生物公司的质粒
１－A２３０．１(＋)质粒,并进回收试剂盒说明书操作步骤进行产物的纯化．２．７ PCR产物胶回收 参照TI℃AN.
GEN公司胶.１用．２H．８in 质粒dIII和pcXD及目的片段的酶切hNoAI３内切酶对．１(＋)
以及TLR４的PCR产物进行酶切pcD(N表A３．１检测并纯化回收.
３),凝胶电泳(＋)质粒表Table３ Pl３as 质粒及midandPPCCRR产物酶切体系productenz成分Comp
onentymes体积y
stemHindIIIV０ol．u５me/μ
L０hoI
０．５×M缓冲液c３．０cCDDRNNgAA(１０e３３lr．．１１(＋＋))e空载体×Mbmpty
v/uecPffer
tCorR/凝胶回收产物４．０/１０．０合计dH２Oecycledproduct２１．２．T９ot al
３２０．．００
/１６．０目的基因片段与载体的连接及转化 把酶切的p
过夜cDNT(AL连接反应体系见表３R．１４片段与＝３:１)置于pcD１N６A３．１(＋)载体(TLR４:
菌DH５α感受态细胞(感受态细胞４)℃的连接仪上进行连接.连接产物转化大肠杆:连接产物１＝１０:
温培养),接种于含１２~１６hAmp抗性的.
L
B固体培养基,３７℃恒表Table４ C４ 连接体系
onnections成分y
stemTComp
onent体积VocLDRN４目的片段(载体TLR４targetfrag
ment３lu．０me/μ
LTc０４DDNA×TNA３３．４DA．１１连接酶(＋＋))veNA连接缓冲液Tct４DorNAL１０igdH２O
×Tase１．４DNALig
aseBuffer０１．０．５合计Total
４．５
０１０．０
上游引物下游引物F扩增模板R０Amplifiedtemplate微量菌落０．．５５合计dH２O
Total
表６２８０．．０
０
Table６ Recombinan 重组质粒双酶切体系
tplasmiddoubleenzymecuttingsstem成分Comp
onent体积V０oly
HindIII．u５me/μ
LXhoI
０．５０c×M缓冲液１０×Mbuffer
３．０
ccDDDNNNAAA３３３．．．１１(１Ｇ(T＋＋)L)Re空载体/４rmpetcyov
mep
cbctiDnoraN/ntA３pl．a１sＧmTiLdR４重组质粒４．０合计dH２O
１．２．T１o１ tal
２３２０．．００
细胞的电转 经检测鉴定成功的NA２３．１ＧTLR４重组质粒转染到内膜基质细胞(p参照cDＧ
１．,在培养液中加入L．３相关细胞培养方法)的PS继续培养至,之后进行４８h、７１μg
/LW２h后收集细胞用于细胞蛋白质的提取esternblot蛋白表达检测.
２２． 结果与分析
１ T为了后续细胞试验的进行LR４受体蛋白在子宫内膜中的分布
,采用免疫组织化学染色的方法对TLR４受体蛋白在绵羊胚胎附植期不同阶段子宫内膜组织进行检测,发现质(TLR４在基２).Sr在妊娠第)、腺上皮９(、G１E３)、１和腔上皮７天绵羊(L子E宫)
上均有表达内膜上皮细(胞图(GE、LE)TLR４蛋白的表达量要高于基质细胞(Sr),且第１７天表达量较少;随着妊娠时间的增长和子宫内膜结构的变化,在第在基质细胞的表达明显增强,２高１、于２５天上皮T细LR胞４蛋白表达.
这些现象提示了TLR４受体在胚胎附植过程中起到了一定的作用.
d１X１p
pPddppp
p
pd１２２
家畜生态学报
第４０卷
图２ TLR４受体蛋白在绵羊不同附植期子宫内膜中的表达(２００×)基质;腺上皮;腔上皮;棕色免疫信号为阳性.下同.Sr．GE．LE．,,,;a~e．９d１３d１７d２１dand２５df．２１dneativecontrolg
妊娠第９、第２a~e．１３、１７、２１、２５天;f．１天阴性对照
Fi．２TheexressionofTLR４recetorproteininendometriumofsheeithdifferentimlantationperiods(２００×)gpppwp;Sr．matrixGE．landulareithelium;LE．cavitieseithelium;brownimmunesinalwaspositive．Thesamebelow．gppg
在子宫内膜基质细胞中２．２ 波形蛋白(Vimentin)的表达鉴定
对妊娠绵羊子宫内膜组织和实验室保存提供的细胞分别进行了免疫组织化学检测及细胞免疫化学).采用内膜基质细胞的特异性标特性的检验(图３——波形蛋白(记蛋白—与非特异性蛋Vimentin)
子宫内膜组织的定位表达检测发现:Vimentin在子宫内S而在Lr部位呈现出明显的阳性反应,E部位.对实验室保应,而在S图３r部位表达呈阴性(b));表达微弱,图３GE部位表达呈阴性(aCtokeratiny
在子宫内膜LE和GE部位均表现出明显的阳性反
——角蛋白抗体()白—进行组织的定位表Ctokeratiny
达及细胞的定性检测,以验证该细胞为基质细胞.
).图３Ctokeratin呈现阴性(ey
),存的细胞检测发现:图３Vimentin检测呈阳性(d
))波形蛋白(抗体组化;角蛋白(抗体组化;阴性对照;基质细胞Va．Vimentinb．Ctokeratinc．d．imentin抗体免疫;y
(Fi．３ TheexressionofTLR４recetorproteinindifferentendometriumofshee１００×)gppp
;;;a．histochemicalofvimentinantibodb．histochemicalofctokeratinantibodc．neativecontrolyyyg
基质细胞C阴性对照e．tokeratin抗体免疫;f．y
图３ TLR４受体蛋白在绵羊不同附植期子宫内膜中的表达(１００×)
;;d．amatrixcellVimentinantibodimmunizatione．amatrixcellCtokeratinantibodimmunizationf．neativecontrolyyyg
第６期 孔维欢,等:子宫内膜中TLR４的定位及pcDNA３．１ＧTLR４载体的构建２．３ TLR４基因cDNA全长序列的扩增
对绵羊子宫组织TLR４cDNA全长序列进行扩),与目的片段大小一致.４
增,结果显示,在２５图２３bp处有明显的扩增条带(
２３
２．４ 菌落PCR鉴定
菌落PCR鉴定结果显示,PCR产物大小均为左右,初步说明T２５２３bLR４基因片段已经转入p
).构建的质粒表达载体中(图５
图４ TLR４cDNA全长序列扩增结果
ig．４M． DNAMarker;１~３．TLR４基因全序列目的条带
M．TLDRN４cADMNaAfrkeurllT;１leLR~n４３gtg．hsetnhebeeqcuaoenmncd
peletaemsp
eliq
fuiceantcioenofresults２．５ 重组质粒过菌落pcPDCNRA３鉴．１定ＧT的LR重４双酶切鉴定
对经组质粒进行ⅢHind和XhoⅠ双酶切,得到大小为５４２８bp的载体条
带和T２５２３bp左右的基因条带(
图６),进一步说明２L．６R ４基因片段插入载体的位置正确.
质粒测序鉴定
将重组质粒送上海生工进行测序,结果测序的
图６ 质粒pcDaNrAk３er．１１ＧT,３L．R４双酶切结果
M．DNAM;重组质粒;双酶切产物;Fig．６ DM．oubleen２zy,４me．cuttingr
esult５s．
阴性对照ofplasmidpcDNA３．１ＧTLR４２,４．pDroNduActMsaorfkderou;１bl,e３d．itgheestrieocno;m５b．innaegntatipvlaescmoind
３tr;ol． 讨１ T反刍动物在胚胎着床时不同于其他一般哺乳动L 论
３R４受体蛋白在子宫内膜中的定位表达
物似的位于血管较多的子宫腔中子宫系膜的另外一侧,它的胚胎附植部位大多数在子宫角内下１/３处.
图M．D５ TLR４菌落PCR扩增结果
M．gNAD NTMALarRkM４cer;ao１lo~n１３．TCLRaR４重组质粒;阴性Fi．５mlification１r４es．ults基因全序列与prlaksermi;１yd~P;１１４３．．neTg
LpatRi４rveecombinant
之后的细胞功能验证试验UCSC公布的序列完全一致,可进行.
２．７ WesAternblot检测蛋白表达
以G经转然后的细胞中能TPLDH为内参基因,够检测到R４蛋白的表达明显增强(图重组质粒载体构建成功,转染能够提高该受体蛋白７),说明的表达水平.
图表达检测
Fig．７ Ex７p
r 转染蛋白essionoftraTnLsfRe４ctedproteinTLR４广泛意义上来说胚胎着床是指胚泡与子宫内膜发生了生理性的结构变化,使子宫内膜上皮细胞增殖分化与相邻上皮细胞之间发生融合,及滋养层细胞和子宫内膜之间融合后促使胚胎和子宫建立的一种紧密联系的过程.该过程失败导致妊娠失败,在自然交配和人工授精的生殖过程中广泛存在.
F２４
家畜生态学报
子宫内膜和滋养层细胞间具有协同作用的细胞
第４０卷
２０]
表达,而波形蛋白在非上皮细胞中特异性表达[的
外基质、粘附分子及相关酶类,形成了激素调节－细胞因子调节－蛋白酶调节系统,为胚胎的着床奠定
１３]
.在繁殖免疫调控中,了基础[子宫内膜为子宫免
特性完全一致,足够说明细胞的完整性.
３．３ 真核载体的过表达
探索研究一个基因的新功能,往往会把这个基因导入细胞或生物体内进而观察细胞状态的变化或生物体表型遗传性状的改变来发现该基因的新功
２１]
.研究证实探索基因新功能的方法有很多,能[例
//胞和基质细胞通过TLR４CD１４MD２复合物识别
[４]
,活化的TLPS激活信号通路１LR４信号通路便诱导促炎症因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子和前列腺素等分泌.现已证实,子宫内膜上皮和
]１５
.一般反刍基质是胚胎附植和胎盘形成的部位[
受外界细菌感染提供了唯一的免疫屏障.当上皮细
如分子生物学里常用的基因过表达和基因敲除等,均是采用同源重组的方法把外源基因导入受体的一
]１９,２２Ｇ２３
.将目的基因敲入或剔除是细胞种技术手段[
动物胚胎着床开始于血管结构且腔上皮有明显皱褶１６~１７d,,腺体和血管腔交错之后子宫内膜出现分布,至第黏附的附植２１天出现孕体长度变长完成与子宫阜的过程.在激素和各种因子的调控作用下,子宫内膜会进一步发育出现上皮细胞脱落,继而
激发基因程序化表达[
１６
]现,TLR４受体在妊娠绵羊子宫内膜各部位均有.本试验通过免疫组化发表达,且在第１７天基质内表达最弱,之后２１d、２５d基质内表达明显增强.推测这与调控因子刺激激素的抑制或释放有关TLR４信号通路的
,从而使得胚胎附植过程处于一个相对正常的繁殖状态.另外,结合有可能与早期胚胎附植相关TLR４mRNA荧光定量的结果揣测,该受体很.
．２ 子宫内膜基质细胞标记蛋白的定性表达
目前关于子宫内膜细胞的体外分离培养文献报道很多.例如,在小鼠、人、奶牛、猪、兔等哺乳动物
中均已成功分离出了所需要的细胞.Zhang等
[１７]在猪子宫内膜中成功分离出了一种基质细胞并对方
法进行了完善,之后[.为此,我们依据角蛋白能够在上皮细胞中特Blitek等１
８]
对该方法也进行了改进异性表达,而波形蛋白在非上皮细胞中特异性表达
的特性[１９]
检测,进一步确认所保存的基质细胞的完整性,采用了细胞免疫化学的方法对细胞进行
.
首先,针对的特异性采用了免疫组化技术检测Vimentin和Cy
tokeratin两种抗体.对比发现entin抗体在基质细胞发生明显的阳性反应,ViＧ
okeratin抗体不能在基质细胞上呈现阳性反应C,y
说Ｇ明了两种抗体的特异性.然后采用细胞免疫化学特性,对保存的细胞进行化学鉴定,发现细胞能够与为内膜基质细胞而非上皮细胞riamtiennt抗体反应in抗体染色呈现棕色的阳性反应,而结果与阴性结果一致,验证C了y
t细ok胞Ｇ.这与前期子宫内膜组织抗体免疫组化特异性表达一致.
综上所述,与角蛋白能够在上皮细胞中特异性
及个体水平上检测其形态学及生化指标的重要参考,进而来确定基因缺失对细胞核以及个体的影响.
本试验通过构建表达载体,成功搭建pc了D由NA组３．织１(学＋到)－T细胞LR学４真核
研究T为后续实验探究因在附植功能调控机制方面提供了方法LR４功能的一个桥梁,.
TLR４基４ 小LR 结
T４受体蛋白在绵羊胚胎附植期不同阶段的
子宫内膜各部位均能够表达,且随着妊娠时间的增长和内膜结构的生理变化及各因子间相互作用调控作用,从而引起激素的释放或抑制,导致TLR４受体蛋白在各部位的表达呈现一定的动态时空模式.推测TLR４很有可能在胚胎附植期间发挥一定的作用.
同时,成功构建了真核表达载体,在内膜基质细胞蛋白表达水平上得到了进一步验证.初步表明在组织学和细胞学方面相关作用得到了发挥,T但其调控机理有待后续探讨LR４受体在胚胎附植早期的.参考文献:
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[]dasoftheoestrousccleJ．ReroductioninDomesticAnＧyyp
orcineeithelialandstromalendometrialcellsondifferentpp
[],/１４ GUOJCHENL,LUON,etal．LPSTLR４ＧmediatedstroＧ
malcellsacuireaninvasivephenoteandareimlicatedinqypp
LocalizationofTLR４inEndometriumandConstructionofpcDNA３．１ＧTLR４Vector
(,１．ColleeonimalScienceandTechnoloShiheziUniversitShiheziXinian３２０００,China;gfAgy,y,jg８
１２２２∗２∗
,KONGWeihuanDAIRonenchenSHIGuoing,WANPgg,qg
,
,２．AnimalHusbandrndVeterinarnstitute,XiniancademriculturalandReclamationScience,ShiheziXinian３２０００,China)yayIjgAyofAgjg８
constructaTLR４eukaroticexressionvectorandprovideatechnicalmeansforthestudfthefunctionypyo
,,,,,)ofTLR４atthecellleveltheuterinetissuesoftheearlrenantshee９d１３d１７d２１d２５dwereypgp(wasdetermined．TheconstructedpcDNA３．１(＋)ＧTLR４plasmidwastransfectedintotheidentifiedreceＧp
,torcellsandtheexressionlevelofTLR４proteinwasdetected．TLR４proteinwasexressedinallpartsppweremainlxressedafterimlantationof１７d．Aftertransfectionofrecombinantplasmidintostromalyepp,cellstheexressionlevelofTLR４proteinwassinificantlnhanced．cDNA３．１(＋)ＧTLR４exressionpgyeppimmunolounction．gyf
:;KeordsTLR４;endometrium;immunohistochemistrcDNA３．１ＧTLR４;vectorconstructionypyw,vectorwassuccessfullonstructedwhichlaidatheoreticalfoundationforTLR４inthestudfermcellycyog,ofendometrium,showinnamicsatialandtemoralpattern．Moreoverendometrialstromalcellsgadyppselected．ThedistributionandexressionofTLR４proteinintheuterustissuesofallstaesweredetectedpg
,bimmunohistochemistrndimmunoloicalantibodolorinandtheexressionoftherecetorproteinyyagycgpp
:AbstractTostudhesecificdistributionandexressionofTLR４proteininendometrium,andtoytpp
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