*CN102772782A*
(10)申请公布号 CN 102772782 A(43)申请公布日 2012.11.14
(12)发明专利申请
(21)申请号 201210138217.X(22)申请日 2012.05.07(66)本国优先权数据
201110116369.5 2011.05.06 CN(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院
地址200031 上海市徐汇区岳阳路319号(72)发明人谢东 李晶晶 印宏坤 刘将(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公
司 31100
代理人韦东(51)Int.Cl.
A61K 38/08(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)G01N 33/574(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 21 页权利要求书2页 说明书21页序列表 12 页 附图 13 页序列表12页 附图13页
(54)发明名称
一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2(57)摘要
本发明涉及一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2，更具体而言涉及一种具有抗癌活性的含有YFPGQFAFS序列或其变异体的多肽。本发明还涉及该多肽在制备治疗或预防癌症的药物中、制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。本发明还涉及一种用于癌症预后的检测试剂盒，通过检测对象样品中视黄酸受体应答蛋白2的表达量对癌症患者的生存期进行评估。CN 102772782 ACN 102772782 A
权 利 要 求 书
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1.具有抗癌活性的多肽在制备治疗或预防癌症的药物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中含有：
（1）YFPGQFAFS；或（2）在YFPGQFAFS中经过取代、缺失、添加或化学修饰一个或数个氨基酸残基且保留YFPGQFAFS的生物学活性或功能的变异体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的变异体为：X1X2PGQFAFX9，其中，X1、X2为芳香族残基或疏水残基，X9为丝氨酸残基或C末端羧基中的羟基被氨基取代的天冬氨酸残基（D-CONH2）。
3.如权利要求1～2中任一项所述的应用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的变异体选自：AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-CONH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF或FPGQFAFS。
4.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述多肽选自：（1）YFPGQFAFS、AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-CONH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF或FPGQFAFS；
（2）SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:2中经过取代、缺失、添加或化学修饰一个或数个氨基酸残基且保留SEQ ID NO:2的生物学活性或功能的氨基酸序列；和
（3）SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO:49中经过取代、缺失、添加或化学修饰一个或数个氨基酸残基且保留SEQ ID NO:49的生物学活性或功能的氨基酸序列。
5.编码权利要求1～4中任一项所述多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
6.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述多肽用于制备抑制患者癌细胞转移能力的药物。
7.如权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述多肽用于制备抗肿瘤血管生成的药物。
8.权利要求1～4中任一项所述多肽、所述多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。
9.如权利要求1～8中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症选自甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、皮肤鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌或前列腺癌。
10.如权利要求1～8中任一项所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。11.一种用于癌症预后的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中的视黄酸受体应答蛋白2水平的试剂。
12.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2编码序列或其受体的编码序列的核苷酸引物。
13.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2或其受体的抗体。
14.如权利要求11～13中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括指导进行癌症诊断的说明书。
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权 利 要 求 书
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15.能检测视黄酸受体应答蛋白2的试剂在制备用于癌症预后诊断的试剂盒中的应用。
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说 明 书
一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2
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技术领域
本发明涉及癌症防治领域，尤其涉及视黄酸受体应答蛋白2及其C末端活性片段
在癌症防治中的应用。
[0001]
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最常见，且最具危害性的癌
症之一，位列世界第五大常见癌症，以及第三大常见癌症相关死因，仅次于肺癌和胃癌。肝癌细胞生长极为活跃，侵袭性强，易侵犯包膜和血管，由于肝内有丰富的血窦，因此肝内转移最为常见，多数患者早期即可有肝内转移。肝癌细胞侵犯门静脉分支形成癌栓，肝癌伴有门静脉癌栓被认为是预后差的主要指标之一。肝外转移以血行转移为主，多见于晚期病人，肺为HCC肝外最常见的转移器官，其次为骨，肾上腺，肾，脑等。肝癌的高转移率，是肝癌预后较差的重要原因。因此，研究肝细胞癌的转移及恶化机制，发展有效的治疗策略，是当前刻不容缓的任务。
[0003] Chemerin，亦名为tazarotene-induced gene 2（TIG2），或retinoic acid receptor responder 2（RARRES2，视黄酸受体应答蛋白2），最早被鉴定为存在于银屑病皮损中的一个新的类维生素A应答基因。后来，它被鉴定为孤儿G蛋白偶联受体chemokine-like receptor 1 （CMKLR1，也称ChemR23）的一个分泌型配体，首次揭示了它的生物学功能。之后更多的研究表明，chemerin还是另外两个受体：chemokine(C-C motif)receptor-like(CCRL) 2和G protein-coupled receptor(GPR)1的配体。不过，这两个受体在哺乳类动物中的功能还不是很清楚。
[0004] chemerin通常以一种活性微弱的前体形式（prochemerin）被分泌出细胞，需要将C端的数个氨基酸剪切掉，成为活性形式，激活它的受体ChemR23。由于不同的酶的识别和剪切序列不尽相同，因此可得到chemerin-154，155，156，157等多种形式（对应着C末端的9，8，7，6个氨基酸被剪切掉）的活性chemerin。据文献报道，chemerin-157的C末端，尤其是第149-157位的九肽（chemerin-9），对于chemerin受体的激活是非常关键的，chemerin-9保留了chemerin-157的绝大部分激活受体的活性。
[0005] 涉及先天性免疫和后天性免疫的许多种细胞都表达chemerin受体CMKLR1，目前，已知chemerin扮演着趋化因子的角色，将这些细胞招募到淋巴器官和组织受损处。此外，研究报道chemerin的表达和分泌在脂肪细胞分化过程中显著升高。而且，在细胞模型中，chemerin或者CMKLR1表达的丧失几乎完全阻止了脂肪细胞的生成，并且改变了糖脂代谢中重要基因的表达，包括GLUT4，DGAT2，leptin和adiponectin。这些研究揭示chemerin不仅是一个趋化因子，还扮演着脂肪细胞因子的角色。虽然目前在免疫、心血管疾病及代谢疾病等方面都对chemerin进行了研究并有相关报道，但是，对它在肿瘤方面的作用和机制鲜有报道。这正是我们这项发明中所要阐述的。
[0002]
发明内容
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说 明 书
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本发明第一方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受
体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
[0007] 本发明第二方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制患者癌细胞转移能力的药物中的应用。
[0008] 本发明第三方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。[0009] 在一具体实施例中，所述抗肿瘤血管生成包括抑制癌症发生、发展和/或转移过程中的血管生成。
[0010] 本发明第四方面提供一种用于癌症预后的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中的视黄酸受体应答蛋白2水平的试剂。
[0011] 本发明第五方面提供能检测视黄酸受体应答蛋白2的试剂在制备用于癌症诊断的试剂盒中的应用。
[0012] 本发明第六方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。
[0013] 本发明还包括视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制VEGF的mRNA及蛋白水平的药物中的应用。[0014] 在一具体实施例中，所述视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2的编码序列或其相关多肽或含有所述编码序列的多核苷酸构建物通过抑制VEGF启动子的转录活性，从而下调其mRNA的水平。
[0015] 本发明还包括视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备促进M1巨噬细胞的分化的药物中的应用。[0016] 在一具体实施例中，M1巨噬细胞的分化生成抑癌的微环境，从而实现癌症的抑制和/或治疗。
[0017] 本发明中，视黄酸受体应答蛋白2选自：[0018] （1）SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或[0019] （2）在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO：2的生物学活性或功能的氨基酸序列。[0020] 本发明中，视黄酸受体应答蛋白2的编码序列的一个例子如SEQ ID NO：1所示。[0021] 本发明中，视黄酸受体应答蛋白2包括C末端被截短了1－10个氨基酸的截短的视黄酸受体应答蛋白2。在一具体实施例中，用于本发明上述各种方法或用途的视黄酸受体应答蛋白2如SEQ ID NO:2的第21-157位（SEQ ID NO:49）所示，或如SEQ ID NO:2第21－156位、第21－155位或第21－154位氨基酸所示。本发明也包括在截短的视黄酸受体应答蛋白2中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留该截短的视黄酸受体应
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说 明 书
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答蛋白2的生物学活性或功能的氨基酸序列。[0022] 本发明中，视黄酸受体应答蛋白2相关多肽选自：[0023] （1）视黄酸受体应答蛋白2的C末端活性片段或其活性变异体；[0024] （2）含有（1）所述C末端活性片段或其活性变异体的多肽；和[0025] （3）在（1）-（2）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或数个氨基酸且保留（1）-（2）所述的氨基酸序列的生物学活性或功能的氨基酸序列。[0026] 本发明中，视黄酸受体应答蛋白2的C末端活性片段包括含有YFPGQFAFS的C末端活性片段，其长度可在9－20个氨基酸残基。示例性的C末端活性片段包括但不限于SEQ ID NO:25－30和41所示的那些片段。
[0027] 本发明C末端活性片段的活性变异体包括YFPGQFAFS的变异体以及含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的变异体。具体而言，所述变异体包括在YFPGQFAFS中或在含有YFPGQFAFS的C末端活性片段中经过取代、缺失、添加或化学修饰一个或数个氨基酸残基且保留YFPGQFAFS或含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的生物学活性或功能的变异体。[0028] 示例性的变异体包括但不限于X1X2PGQFAFX9（SEQ ID NO:48），其中，X1和X2任选为芳香族残基或疏水残基，X9为丝氨酸残基或C末端羧基中的羟基被氨基取代的天冬氨酸残基（D-CONH2）。
[0029] 示例性的变异体包括但不限于SEQ ID NO:24、26、31－40和42-47所示的氨基酸序列。
[0030] 本发明还包括含有所述C末端活性片段或其变异体的能结合chemerin的受体ChemR23的多肽。这类多肽包括但不限于，例如SEQ ID NO:2第1-157位中含有YFPGQFAFS的长20－156个氨基酸残基的多肽。[0031] 本发明中，含有所述编码序列的多核苷酸构建物可以是一种表达载体，其可表达视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽。[0032] 本发明中，所述癌症选自甲状腺癌，胰腺癌，乳腺癌，头颈部鳞状细胞癌，肝癌皮肤鳞状细胞癌，肾上腺皮质癌或前列腺癌等，优选肝癌。[0033] 本发明中，所述试剂盒可包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2编码序列或其受体的核苷酸引物。
[0034] 所述核苷酸引物的例子包括，例如针对视黄酸受体应答蛋白2编码序列的引物SEQ ID NO:3和4，和针对受体ChemR23的引物序列SEQ ID NO:5和6等。或者，试剂盒中可含有特异性结合视黄酸受体应答蛋白2的试剂，例如视黄酸受体应答蛋白2的特异性抗体等。
[0036] 本发明的试剂盒还可包括指导进行癌症诊断的说明书。
[0035]
附图说明
图1A显示，通过实时PCR，检测单克隆化的、具有不同转移能力的MHCC97细胞中
chemerin的表达水平，表示为单克隆化的细胞（M，H，L）分别与原初细胞chemerin（P）表达的比值，M、H和L三株单克隆化的细胞在体内的转移能力依次降低。图1B显示，通过实时PCR，检测了46对配对的正常肝组织和肝癌组织中chemerin的mRNA表达，表示为肝癌组织（T）与相应的正常肝组织（N）的Log2（T/N）。
[0037]
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说 明 书
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图2A、2B、2C和2D分别代表了组织芯片的chemerin染色的4种情况，分别对应于
评分0，1，2，3。0表示检测不到信号，1表示信号较弱，2表示信号明显，较强，3表示信号很强。图2E显示，结合临床病理信息，对组织芯片的结果进行了分析，chemerin的表达与患者的生存期存在显著正相关（p**=0.000333）。图2F显示，如果将“0，1”统一划为“0”级，把2，3统一划为“1”级，结合临床病理信息，对组织芯片的结果重新进行分析，则chemerin的表达与患者的生存期之间的正相关性更为显著(p**=0.0000724)。[0039] 图3显示通过Boyden小室检测，检测了chemerin对肝癌细胞转移能力的影响。A，7404细胞，7404/v代表对照细胞，7404/chemerin L，7404/chemerin M和7404/chemerin H分别代表chemerin的表达量渐次升高的3个单克隆；B，分别感染了对照病毒和chemerin表达病毒的PVTT-1和C，MHCC97H细胞的pool,其中，PVTT-1 con和MHCC97H con为对照细胞，PVTT-1 chemerin和MHCC97H chemerin为高表达chemerin的细胞;D，SK-Hep-1/v为对照细胞，SK-Hep-1/chemerin L和SK-Hep-1/chemerin H为chemerin表达量不同的两个阳性克隆；E，7404/chemerin H icon为感染了对照病毒的细胞，而7404/chemerin H i1和7404/chemerin H i2为感染了含有不同RNAi target序列的细胞；F，通过RNAi，下调了HepG2细胞中chemerin的表达，其中，HepG2 chemerin icon为感染了对照病毒的细胞，HepG2 chemerin i1，HepG2 chemerin i2，HepG2chemerin i3分别代表感染了包含3条不同的RNAi target序列的病毒的细胞。[0040] 图4A显示Western Blot的结果，该结果显示了在7404（左）和PVTT-1（中）肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中Akt的磷酸化水平（Ser473），右则显示了在通过RNAi将chemerin的表达敲低的HepG2细胞中，Akt磷酸化水平的变化。图4B显示，使用1 nM的具有活性的chemerin重组蛋白对7404细胞进行处理，通过Western Blot检测了Akt磷酸化水平的变化。
[0041] 图5A显示了半定量PCR的结果，显示了在7404（左），PVTT-1（中）和MHCC97H（右）肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中VEGF的mRNA水平，包括VEGF165和VEGF121这两个异构体。图5B显示了Western Blot的结果，显示了在7404（左），PVTT-1（中）和MHCC97H（右）肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中VEGF的蛋白水平，包括55kDa附近的同型二聚体，以及17kDa附近的单体。图5C显示了小管形成实验（Tube formation assay）的结果，分别使用来自7404/v，7404/chemerin，PVTT-1 con，PVTT-1 chemerin，MHCC97H con，MHCC97H chemerin细胞的条件培养基（conditioned medium，CM），通过小管形成实验检测了来自对照和高表达chemerin的肝癌细胞的CM对HUVEC（人脐静脉内皮细胞）细胞体外血管形成能力的影响。
[0042] 图6显示通过Boyden小室检测了chemerin对肝癌细胞转移能力的影响的结果。其中：A，SK-Hep-1 con为对照细胞，SK-Hep-1/chemerin L和SK-Hep-1/chemerin H为chemerin表达量不同的两个阳性克隆（见C）；B，7404/chemerin H icon为感染了对照病毒的细胞，而7404/chemerin H i1和7404/chemerin H i2为感染了含有不同RNAi靶序列的细胞；C，通过Western Blot检测了在过表达chemerin的SK-Hep-1细胞克隆中，以及chemerin被knockdown的7404/chemerin H细胞克隆中，标注分子的表达变化。[0043] 图7显示，分别使用来自A，SK-Hep-1 con和SK-Hep-1/chemerin和B，7404/chemerin H icon，7404/chemerin H i1，7404/chemerin H i2细胞的条件培养基（CM），通
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说 明 书
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过小管形成实验，检测了来自对照和高表达chemerin/chemerin表达被抑制的肝癌细胞的CM对HUVEC细胞体外血管形成能力的影响。
[0044] 图8A将PVTT-1 con及PVTT-1 chemerin细胞对6周大的裸鼠分别进行左心室注射，利用IVIS-imagingsystem，监测标记了荧光素酶的PVTT-1细胞的体内转移情况。图8A中显示了第0天（注射后立即检测）、第14天和第28天的情况；图8B显示了肝脏注射的结果，分别从正面和背面显示了PVTT-1 con组和PVTT-1 chemerin组中具有代表性的小鼠肝脏，白色实线箭头所指为注射处形成的原发灶，白色虚线箭头所指为表面可见的癌灶（foci）；图8B还显示分别对应于PVTT-1 con组小鼠（上）和PVTT-1 chemerin组小鼠（下）的肝脏切片进行的H.E.染色；图8C显示，对PVTT-1 con组和PVTT-1 chemerin组的小鼠的注射叶表面可见的癌灶（左）和非注射叶的表面可见的转移的癌灶（将这些癌灶定义为肝内转移灶）的计数统计。[0045] 图9显示，通过实时PCR，对已分化为巨噬细胞，并经过PVTT-1 con和PVTT-1 chemerin细胞的条件培养基处理的已分化为巨噬细胞的THP-1细胞进行分析，包括M1型巨噬细胞的标记分子TNF-alpha（A），IL-12a（B），IL-6（C）的表达，以及M2型巨噬细胞的标记分子CCL24（D）的表达。Control为阴性对照，LPS刺激为阳性对照（见“材料与方法”）。[0046] 图10显示，利用AKTA purifer和Q Sepharose FF，SP Sepharose FF纯化得到的chemerin蛋白（电导率曲线反映溶液中离子浓度的变化）；B，使用纯化得到的蛋白进行长时处理，通过Western Blot检测Akt磷酸化水平的变化。[0047] 图11显示，利用肝内注射荧光标记的PVTT-1细胞原位成瘤，使用chemerin进行处理，以探索chemerin对肝癌的治疗潜力。A，PBS对照组和chemerin处理组的生存曲线（n=10，数据截止处理第6周，虚线代表PBS对照组，实线代表chemerin处理组））；B，PBS对照组和chemerin处理组的平均体重曲线，从第1天（以第一次腹腔注射蛋白为第1天）开始测定，每隔四天称量一次，直至第33天，结果以平均数±标准误（n=10），实心框线代表PBS对照组，空心框线代表chemerin处理组。[0048] 图12显示，通过Boyden小室检测，检测细胞外活性形式的chemerin对肝癌细胞迁移能力的影响。A：分别对7404和PVTT-1细胞使用10nM的活性形式的重组chemerin进行预处理（0.5h），在实验的过程中（7404：8h，PVTT-1：6h），每隔2h分别在对照孔中加1ul PBS，在chemerin处理的孔中加1uL 100xchemerin，以保持chemerin的持续作用；B：对7404/chemerin H细胞分别使用1ug/ml和10ug/ml的chemerin抗体（R&D，Cat.No:AF2324，配制于PBS中）进行预处理（0.5h），然后进行Boyden小室检测，在对照组中，以相同浓度的正常羊IgG作为对照（抗chemerin抗体是羊来源的）。[0049] 图13显示，在7404/chemerin H中分别转入空载体和表达持续活化形式的Akt的CA-Akt，然后，A：和7404 con细胞一起进行Boyden小室检测；B：通过Western blot对CA-Akt的转入进行鉴定。HA表明外源CA-Akt的表达，GSK-3beta为Akt的下游靶标，p-GSK-3beta（Ser9）的水平上升表明Akt下游通路的激活。[0050] 图14显示，使用包含人VEGF启动子的荧光素酶报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因测试（Dual luciferase reporter assay），检测chemerin对VEGF启动子的转录活性的影响。A、B、C分别为在三种不同的肝癌细胞系7721，Huh7和7404中的结果。[0051] 图15显示，通过Boyden小室分析检测了chemerin-9和chemerin对7404细胞迁
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说 明 书
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移能力的影响。分别使用10nM chemerin-9和活性形式的重组chemerin对细胞进行预处理（0.5h），在检测过程中（8h），每隔2h在对照孔中加1ul PBS，在chemerin-9和chemerin处理的孔中分别加入1ul 100x原液，以保持chemerin-9和chemerin的持续作用；B，分别使用1nM的chemerin-9和活性形式的重组chemerin对7404细胞进行处理，2h后收取样品，通过Western Blot检测Akt磷酸化水平的变化（左），右为对Western Blot结果的辉度扫描定量图。
具体实施方式
[0052] 用于本发明的chemerin包括含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列（其中，第1－20位为信号肽）的多肽及其保留chemerin生物学活性的活性片段。[0053] 本发明的chemerin还包括具有与chemerin蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为1 0个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。下表显示了代表性的氨基酸取代。
[0054]
氨基酸残基代表性的取代Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)
Val;Leu;IleLys;Gln;AsnGln;His;Lys;ArgGluSerAsnAspPro;AlaAsn;Gln;Lys;ArgLeu;Val;Met;Ala;PheIle;Val;Met;Ala;PheArg;Gln;Asn
优选的取代ValLysGlnGluSerAsnAspAlaArgLeuIleArg
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Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V)
[0055]
说 明 书
Leu;Phe;IleLeu;Val;Ile;Ala;TyrAlaThrSerTyr;PheTrp;Phe;Thr;SerIle;Leu;Met;Phe;Ala
LeuLeuAlaThrSerTyrPheLeu
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多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突
变体、在高或低的严紧度条件下能与chemerin的DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含chemerin蛋白或其片段的融合蛋白。[0056] 本领域公知不同种属间的同源蛋白往往具有相似的功能。chemerin在不同种属中的同源蛋白的相同性（Identity）为30~90%，例如小鼠chemerin与人chemerin的相同性为63%。因此，本发明也包括与人chemerin（SEQ ID NO:2）的相同性大于60%且保留chemerin生物学活性的多肽。优选为相同性大于70%、80%、90%、95%或98%的多肽。[0057] 通常，chemerin以一种活性微弱的前体形式（prochemerin）被分泌出细胞，需要将C端的数个氨基酸剪切掉，成为活性形式，激活它的受体ChemR23〔也称为CMKLR1(chemokine-like receptor)（Gene ID:1240）〕。有多种酶（如丝氨酸蛋白酶,包括中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶和和组织蛋白酶G、肥大细胞分泌的类胰蛋白酶等）参与了C端氨基酸的剪切，以及chemerin的活化，得到chemerin-154，155，156，157，158等多种形式（对应着C末端的9，8，7，6，5个氨基酸被剪切掉），因为各种酶的识别和剪切序列不一样。这些形式的chemerin都可以在生理状态下，从体液中检测到。因此，本发明也包括这些C末端被截短了1－10个氨基酸的截短的chemerin片段，即chemerin的活性形式。这些多肽包括但不限于SEQ ID NO:2的第1-157位、第21-157位、第21-158位、第21-156位、第21-1 55位、第21-1 54位等。[0058] 另外，在目前已知的被不同的酶剪切后得到的活性chemerin（如chemerin-154，155，156，157，158等）中，chemerin-157的活性是最强的。因此，为了在体内得到更为稳定的chemerin-157的活性形式的蛋白，可以将除Ser157外的其他几个剪切位点的氨基酸突变，使得体内的酶无法识别这些位点并进行剪切，从而得到更为稳定，并保留chemerin-157活性的蛋白。这些突变后的多肽也包括在本发明的范围内。[0059] 本领域已知（Wittamer V et al.,The C-terminal Nonapeptide of mature chemerin activates the chemerin receptor with low nanomolar potency,J Biol.Chem.2004,12;279(11):9956-62），chemerin的C末端片段或其变异形式也同样具有成熟chemerin的生物学活性。因此，这些C末端片段也包括在本发明的chemerin活性片段的范
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围之内。特别地，本发明chemerin的C末端片段为chemerin活性形式的C末端片段。更进一步地，本发明chemerin的C末端片段含SEQ ID NO:2第150-157位氨基酸残基（FPGQFAFS，SEQ ID NO:24），优选含YFPGQFAFS（SEQ ID NO:28）。通常，所述片段长8-20个氨基酸残基，例如长9-19个氨基酸残基。在优选实施例中，所述片段为FPGQFAFS。在其它实施例中，所述C末端片段位于SEQ ID NO:2的第139-157位之中（可包括第139和/或157位），且含FPGQFAFS，优选含YFPGQFAFS。
[0060] 优选实施例中，本发明chemerin的C末端片段包括但不限于：QRAGEDPHSFYFPGQFAFS（SEQ ID NO:2第139-157位，SEQ ID NO:25）、QRAGEDPHSFYFPGQFAF（SEQ ID NO:2第139-156位，SEQ ID NO:26）、FPGQFAFS（SEQ ID NO:2第150-157位，SEQ ID NO:27）、FYFPGQFAFS（SEQ ID NO:2第148-157位，SEQ ID NO:28）、HSFYFPGQFAFS（SEQ ID NO:2第146-157位，SEQ ID NO:29）、PHSFYFPGQFAFS（SEQ ID NO:2第145-157位，SEQ ID NO:30）、YFPGQFAFS（SEQ ID NO:2第149-157位，SEQ ID NO:41）等。
[0061] 本发明也包括上述C末端片段的变异形式。这些变异形式与所述C末端片段相比，具有一个或几个氨基酸插入、缺失或取代，同时仍保留所述C末端片段的生物学活性，尤其是本文所述的治疗或预防癌症（尤其是肝癌等）、抑制患者癌细胞转移能力、抗肿瘤血管生成、抑制Akt信号通路和/或抑制VEGF的mRNA及蛋白水平的活性或功能，或者说结合Chemerin受体〔CMKLR1(chemokine-like receptor)，Gene ID:1240〕的活性或功能。示例性的C末端片段的变异形式包括但不限于Wittamer V等（同上）以及US 7419658B2（本文将这些文献公开的全部内容以引用的方式纳入本文）中所列出的各种变异形式，包括但不限于AFPGQFAFS（SEQ ID NO:3 1）、YAPGQFAFS（SEQ ID NO:32）、YFAGQFAFS（SEQ ID NO:33）、YFPAQFAFS（SEQ ID NO:34）、YFPGAFAFS（SEQ ID NO:35）、YFPGQAAFS（SEQ ID NO:36）、YFPGQFAAS（SEQ ID NO:37）、YFPGQFAFA（SEQ ID NO:38）、YHSFSFPGQFAFS（SEQ ID NO:39）、YHSFFFPGQFAFS（SEQ ID NO:40）等。[0062] 本领域已知，YFPGQFAFS的N末端中的芳香和疏水残基对YFPGQFAFS的受体结合活性是必需的；且本领域也已证实，将YFPGQFAFS的N末端（包括N末端第1和2位）突变为芳香族残基或疏水残基，所得突变体仍保留受体结合活性。此外，可对YFPGQFAFS的C末端进行修饰，例如将D取代S，并进行酰胺化修饰。修饰所得的产物仍保留有所述C末端片段的生物学活性。例如，可参见US 7666401B2（本文将其全文已引用的方式纳入本文），尤其可参见此文献实施例22（SEQ ID NO:92-97）。因此，本发明也包括这类修饰的C末端片段变体，包括但不限于LFPGQFAFS（SEQ ID NO:42）、IFPGQFAFS（SEQ ID NO:43）、FLPGQFAFS（SEQ ID NO:44）、YLPGQFAFA（SEQ ID NO:45）、YVPGQFAFS（SEQ ID NO:46）和YFPGQFAFD-CONH2（SEQ ID NO:47）。[0063] 应理解，本发明也包括chemerin、其活性片段（包括chemerin的活性形式、C末端片段）或其变异体的各种本领域周知的修饰形式。这些修饰包括但不限于N端的疏水性修饰，如豆蔻酰化修饰、或硬脂酸修饰、或棕榈酸修饰、或胆固醇修饰；和/或C端的稳定化修饰，如酰胺化修饰或异戊二醇化修饰。本发明还包括那些其C末端为上述chemerin的C末端活性多肽的能与chemerin的受体ChemR23结合的多肽。[0065] 此外，本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本
[0064]
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发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0066] 可使用市售的各种chemerin产品来实施本发明的技术方案。[0067] 本文中，“保留SEQ ID NO：2或chemerin的生物学活性或功能”包括保留SEQ ID NO：2或chemerin的现有已知的生物学活性或功能，也包括保留本文所述的治疗或预防癌症（尤其是肝癌等）、抑制患者癌细胞转移能力、抗肿瘤血管生成、和/或抑制Akt信号通路的活性或功能。
[0068] 本发明还提供了编码本发明chemerin或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。SEQ ID NO:1为编码SEQ ID NO:2的多核苷酸序列之一。
[0069] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成
熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。[0071] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0072] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0073] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0074] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度通常为15～30个核苷酸，一般为18～24个核苷酸。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码chemerin蛋白的多聚核苷酸。
[0070]
本发明的chemerin蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法获得。对
于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩
[0075]
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增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0076] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或chemerin蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。可通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的chemerin蛋白。
[0077] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含chemerin蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0078] 包含上述适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0079] 本发明也包括这些多核苷酸序列或表达载体在制备治疗或预防癌症的药物、制备抑制患者癌细胞转移能力的药物、制备抗肿瘤血管生成的药物、制备用于癌症患者预后诊断的试剂盒中的应用。
除直接使用chemerin或其编码序列或其表达载体于上述应用之外，还可使用
chemerin的激动剂来实施本发明的技术方案。本文中，“激动剂”指能增加chemerin的表达或活性的物质。激动剂的例子包括但不限于：类维生素A（Sunil Nagpal et.al.Tazarotene-induced Gene 2（TIG2）,a novel retinoid-responsive gene in skin.J Invest Dermatol,1997,109:91-95）；白介素1β，（Kralisch Set al， Interleukin-1 beta induces the novel adipokine chemerin in adipocytes in vitro,Requl Pept,2009,154(1-3):102-6）；胰岛素（可提高脂肪组织外植体chemerin的表达）(Tan BK et.Al.Insulin and metformin regulate circulating and adipose tissue chemerin,Diabetes,2009,58(9):1971-7)；TNF-α（Song SH et.al.,Cloning,expression analysis,and regulatory mechanisms of bovine chemerin and chemerin receptor,Domest Anim,Endocrinol,2010,39(2):97-105）等。[0081] 本发明也包括chemerin激动剂，包括上述具体列出的激动剂，在制备治疗或预防癌症的药物、制备抑制患者癌细胞转移能力的药物、制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。[0082] 本发明还包括一种检测试剂盒，该试剂盒中包含检测样品中chemerin的表达水平的试剂。这些试剂包括，例如针对chemerin的引物序列（例如本文具体列出的SEQ ID NO:3和4）、针对ChemR23的引物序列（例如本文具体列出的SEQ ID NO:5和6）等。还包括chemerin的特异性抗体等等。
[0083] 试剂盒中还可包括实施所述检测所需的各种制剂，包括例如PCR所需的试剂等。试剂盒中还可包括指导技术人员实施所述检测的说明书。
[0084] 本发明的试剂盒可用于检测各种样品中的chemerin的表达水平。所述样品尤其包括癌症组织（包括癌细胞）。检测所得的chemerin的表达水平可以作为预后的独立风险因子。因此，检测还可包括对正常组织或细胞样品的检测，以通过将chemerin在癌组织、细胞样品的表达水平与其在正常组织、细胞样品中的表达水平进行比较而对对象的生存期进行评估。因此，本发明的试剂盒中也可包括显示正常组织、细胞样品的chemerin表达水平
[0080]
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的内容。
[0085]
本文中，术语“癌症”包括本领域周知的各种癌症，尤其包括与Akt活性相关或受
其活性介导的各种癌症，以及癌变组织中chemerin水平下调的各种癌症。本发明发现，Akt活性的抑制对于chemerin抑制肿瘤细胞迁移是非常关键的。已知PI3K/Akt信号通路涉及多种细胞功能，至少在50%的癌症中，都可以观察到该通路的异常激活，包括甲状腺癌，胰
腺癌，乳腺癌，头颈部鳞状细胞癌，肝癌等等。因此，这些癌症都在本发明“癌症”的范围之内。本发明还发现，chemerin的表达在肝癌组织中显著降低。本领域已知，与正常组织相比，皮肤鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌等的癌变组织中chemerin表达水平也显著降低，提示chemerin活性的抑制在这些癌症的发生发展过程中可能起到重要作用，而在这些癌症中给予chemerin以提高chemerin的活性可能成为治疗这些癌症的一种有效手段。因此，这些癌症也包括在本发明“癌症”的范围之内。尤其优选的是，本发明涉及肝癌的诊断（包括预后）、预防和治疗。
[0086] 癌症的发生和发展过程涉及到很多因素，如基因突变、细胞增殖、癌细胞转移、肿瘤血管生成等。因此，本文中的“抗癌活性”可以是针对癌症发生发展过程相关的任何一种或几种因素而达到抑制癌症目的的活性，包括（但不限于）抑制原癌基因表达、抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞转移、抑制肿瘤血管生成等活性。[0087] 此外，本发明也包括视黄酸受体应答蛋白2或其激动剂在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。
[0088] 可以本领域熟知的方式给予本发明的视黄酸受体应答蛋白2或其激动剂，或其编码序列或含有编码序列的表达载体，例如以药物组合物的方式给予。药物组合物中还可含有本领域周知的药学上可接受的载体。药物组合物中的活性成分的量也可由根据技术人员根据常规的技术手段加以确定。
[0089] 本发明也包括一种抑制Akt信号通路的方法，该方法包括给予对象，例如哺乳动物或其组织或其细胞本发明的视黄酸受体应答蛋白2或其激动剂。抑制可以是体内或体外抑制。
[0090] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意
义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。[0092] 材料与方法：[0093] 实验动物
[0094] BALB/c-nu/nu雄性裸鼠由上海中科院斯莱克实验动物中心提供，雄性裸鼠在标准条件下饲养：在SPF(Specifc Pathogen Free Condition)级条件，恒温25-27℃，恒湿45-50%，置于层流超净架内，每个饲养笼内饲养5只裸小鼠。动物实验的操作严格遵守上海生命科学研究院的实验动物管理和使用指南，并得到了动物管理和使用委员会的批准。在
[0091]
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实验中主要使用4～8周龄的裸鼠，并根据具体实验要求进行选择。[0095] 肝癌组织样本
[0096] 所有正常肝组织、原发性及门静脉转移的肝癌样本来自东方肝胆外科医院。这一工作得到了中国科学院营养科学研究所的鉴审批准。[0097] 细胞系
7404，7721，Huh7和THP-1细胞购自中国科学院细胞库，SK-Hep-1和HepG2细
胞购自ATCC，HUVEC（人脐静脉内皮细胞）细胞按照常规方法分离得到（Bruno Baudin et al，A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells,Nature Protocols 2,481-485，2007）。MHCC97P，MHCC97L，MHCC97H，MHCC97M为中山医院汤钊猷教授等人构建的单克隆化的MHCC97细胞，MHCC97P为原初的MHCC97母细胞（Tian J,Tang ZY,Ye SL,Liu YK,Lin ZY,Chen J,Xue Q，New human hepatocellular carcinoma(HCC)cell line with highly metastatic potential(MHCC97)and its expressions of the factors associated with metastasis.Br J Cancer 81:814–821，1999）MHCC97L，MHCC97H（Li Y,Tang ZY,Ye S L,Liu YK,Lin ZY,Chen J,Xue Q,Chen J,Gao DM,Bao WH.Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97.World J Gastroenterol7:630–636，2001.MHCC97M（HCCLM3，李雁，汤钊猷，叶胜龙，刘银坤，陈洁，薛琼，黄晓武，陈军，鲍卫华，杨炯，高东梅，中华医学杂志2002年5月10日第82卷第9期，601-605）分别代表体内转移能力逐渐升高的单克隆化的MHCC97细胞。PVTT-1为本实验室和东方肝胆外科医院程树群教授合作建立的一株来源于肝癌患者门静脉癌栓的细胞系（见已申请受理的发明专利“荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途”，201010555483.3）。[0099] 试剂和仪器
[0100] 用于活体成像的仪器IVIS-Imaging System，以及底物D-Luciferin均购自Xenogen Biotechnology(Xenogen,Alameda,CA,USA)。Matrigel购自BDBioscience。chemerin和VEGF的抗体，以及chemerin重组蛋白均购自R&D，actin 的抗体购自Santa Cruz，P-Akt（Ser473）和Akt的抗体购自Cell Signaling。[0101] 实时PCR分析
[0102] 实验中所检测基因相对应的引物均由PRIMER5软件设计。[0103] chemerin的引物序列为：
[0098] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113]
F:5’-GGTCCACTGCCCCATAGA-3’（SEQ ID NO:3）,R:5’-CTTGGAGAAGGCGAACTGT-3’（SEQ ID NO:4）。ChemR23的引物序列为：F:5’-GGTGGTCTACAGCATCG-3’（SEQ ID NO:5）,R:5’-TGGCGGCATAGGTGA-3’（SEQ ID NO:6）。β-actin的引物序列：F:5’-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’（SEQ ID NO:14）R:5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’（SEQ ID NO:15）M1型巨噬细胞的标记分子引物序列：TNF-alpha：
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F：5′-CCAGGCAGTCAGATCATCTTCTC-3′（SEQ ID NO:16）
[0115] R：5′-AGCTGGTTATCTCTCAGCTCCAC-3′（SEQ ID NO:17）[0116] IL-6：[0117] F：5′-ATGTAGCCGCCCCACACAGA-3′（SEQ ID NO:18）[0118] R：5′-GCATCCATCTTTTTCAGCCATC-3′（SEQ ID NO:19）[0119] IL-12a：[0120] F：5’-GGCCCTGAATTTCAACAG-3’（SEQ ID NO:20）[0121] R：5’-AATAGTCACTGCCCGAAT-3’（SEQ ID NO:21）[0122] M2型巨噬细胞的标记分子引物序列：[0123] CCL24：[0124] F：5’-CATCATCCCTACGGGCTCT-3’（SEQ ID NO:22）[0125] R：5’-TGGCGTCCAGGTTCTTCAT-3’（SEQ ID NO:23）
[0126] 扩增反应体系为20μL的LightCycler-DNA Master SYBR Green I mix(Roche Applied Science,Penzberg,Germany)，包含有10pmol引物、2mmol/LMgCl2、200μmol/L脱氧核苷酸三磷酸混合物、0.5单位Taq DNA聚合酶，以及通用缓冲液。所有反应均一式三份，在iCycler iQ system(Bio-Rad,Hercules,CA)中进行，热循环的条件设置如下：95℃ 3分钟；之后为95℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 20秒，循环40次；最后72℃延伸10分钟。在每个临床样本或所培养的细胞样本中，基于β-actin的所检测基因的相对mRNA水平按照下述方法进行计算。简言之，当经过固定数目的循环后，扩增的PCR产物得以检测到，这个循环数值即被定义为Ct，用它对反应进行描述。未知样本中的目的信息通过测定Ct值进行量化，而β-actin的Ct值亦被作为内源RNA参照。每个样本中所检测基因的表达水平以β-actin的量为基础，通过以下公式进行标准化：
(Ctβ-actin-Ct所检测基因)
[0128] Level所检测基因/Levelβ-actin=2
[0129] 而每一对HCC样本中所检测基因的相对表达水平，当所检测基因tumor>所检测基因normal时，以所检测基因tumor/所检测基因normal计算，当所检测基因tumor<所检测基因normal时，以–(所检测基因normal/所检测基因tumor)计算。使用配对t检验进行统计学分析。当P<0.05时，统计结果被认为是显著的。所有的数据分析均使用SPSS for Windows程序。[0130] 质粒构建
[0131] 我们将人chemerin克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A（Invitrogen公司）中，所用的引物序列为：[0132] F:5’-AtaGAATTCCACCAtgcgacggctgctgatc-3’（SEQ ID NO:7），[0133] R:5’-ataCTCGAGGCTGCGGGGCAGGGC-3’（SEQ ID NO:8）。[0134] 当将此质粒构建好以后，我们将带有myc-His-Tag的chemerin片段亚克隆入病毒载体pSin4-EF2-IRES-Puro（购自Addgene）中，所用的引物序列为：[0135] F:5’-AtaGAATTCCACCAtgcgacggctgctgatc-3’(EcoRI)（SEQ ID NO:9）,[0136] R:5’-ataACTAGTTCAATGGTGATGGTGATGATG-3’(SpeI,His-Tag)（SEQ ID NO:10）。
[0127]
表达荧光素酶的病毒载体的构建详见已申请的专利“荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途（201010555483.3）”。
[0138] 针对chemerin的小干扰RNA的三个靶序列由Ambion的在线工具设计，分别为
[0137]
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chemerin i1:AAGAAACCCGAGTGCAAAGTC（SEQ ID NO:11）
[0140] chemerin i2:AAGTTCTGCGGGAGGCTGAGG（SEQ ID NO:12）[0141] chemerin i3:AAGCCAGCACTGAGATGCGTG（SEQ ID NO:13）[0142] 采用完全扰乱碱基顺序，经PubMed Blast，G+C含量和靶序列一致的序列作为对照序列chemerin icon，它不针对任何人的基因编码序列。FG12 RNAi载体（Qin XF et al,Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5,Proc Natl Acad Sci USA.,2003,100(1):183-8）被用于产生小的双链RNA（小干扰RNA），以在靶细胞中抑制chemerin的表达。
[0143] 活性形式的chemerin重组蛋白表达质粒构建[0144] 人的chemerin基因（hchemerin，GeneBank Accession No.NM 002889.3）的全长为767个碱基，其中编码序列（CDS）为492个碱基。最初的60个碱基编码20-aa长度的信号肽，而最后6-aa的肽段需要从不成熟的蛋白中切除，以获得活性形式的蛋白。因此，我们所纯化的chemerin重组蛋白对应的是GLu21-Ser157，并加上N端Met，和R&D公司商业化售卖的chemerin蛋白序列是完全一致的。我们使用了pET-30a(+)载体（Novagen），引物为：F：5’-GGAATTCCATATGGAGCTCACGGAAGCCCAGCGCCG-3’(SEQ IDNO:24，斜体字为NdeI酶切位点)[0146] R：5’-CCGCTCGAGTTAGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3’( SEQ ID NO:25，斜体字为XhoI酶切位点)
[0147] 经加热、延伸、退火等过程得到全长400多bp的PCR产物，即为表达活性chemerin的基因序列。
[0148] 分别用Nde I和Xho I双酶切PCR回收产物及pET30a原核表达载体的空载体，回收并连接目的片段和空载体。
[0149] 将连接产物转入DH5-alpha大肠杆菌感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆并抽提质粒，并用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定，将阳性克隆送公司进行测序。[0150] rh-chemerin蛋白的原核表达
[0151] 将pET30a-chemerin质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取转化的单克隆加入5mL含卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm震荡培养过夜，次日按1:100接种于400mL含卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm震荡培养至OD600值为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mM/L，37℃、250rpm震荡培养4小时后收集菌液，4℃下6000rpm离心5分钟，弃上清，用1×PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH7.4)重悬，之后于4℃下6000rpm离心5分钟，弃上清，菌体称重。[0152] 根据菌体重量按1mL/0.1g加入含1mM EDTA的PBS缓冲液，重悬细胞，冰上超声沉淀重悬液(超声3秒，间隔10秒，超声功率100瓦，持续超声30分钟)，12000rpm离心15分钟后弃上清，沉淀称重，按1mL/0.1g加入变性缓冲液(6M盐酸胍，1mM EDTA，50nM NaCl，50mM Tris-HCl；pH8.0)，充分震荡溶解后装入透析袋，4℃下分3步进行透析，透析液依次为加入含有不同浓度盐酸胍(4M，2M，0.5M)的复性缓冲液(1mM GSH，0.1mM GSSG，0.4M蔗糖，0.1M Tris-HCl；pH9.5)，每次透析时间均为12小时。
[0145] [0153]
将透析之后的蛋白溶液稀释溶解于10倍体积的稀释缓冲液(1nM GSH,0.1mM
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GSSG,0.1M Tris-HCl；pH9.5)，用1M HCl调节至pH7.5，4℃12000rpm离心30分钟，取上清进行后续的纯化。
[0154] rh-chemerin蛋白的纯化
[0155] rh-chemerin蛋白是按先后通过阴离子交换柱(Q Sepharose FF，GE)和阳离子交换柱(SP Sepharose FF，GE)的方法来纯化的，所使用的蛋白纯化仪为AKTA purifer 100（GE Healthcare Life Science）。阴离子交换柱和阳离子交换柱首先分别用洗涤缓冲液1(20nM Tris-HCl，1mM EDTA，25mM NaCl；pH7.5)和洗涤缓冲液2(50nM NaAc-HAc，1mM EDTA，25mM NaCl；pH4.5)预先平衡好，将离心上清以2mL/min的速度流经阴离子交换柱除去杂质蛋白后，将收集的流出液用冰醋酸调至pH4.5，4℃下12000rpm离心30分钟除去沉淀，然后以2mL/min的流速过SP Sepharose FF，使rh-chemerin蛋白吸附到阳离子交换柱上，最后用梯度为0.025M～1.0M NaCl的洗脱缓冲液梯度洗脱rh-chemerin蛋白，根据紫外吸收峰确定含有rh-chemerin的蛋白洗脱液。将收集管内的蛋白液用1M的Tris-HCl（PH8.5）中和，调节PH值至7.4，然后在4°C下用超滤的方法更换蛋白缓冲液至PBS，再浓缩定量。纯化好的rh-chemerin蛋白进行SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，Western Blot鉴定其正确性，并通过细胞处理实验和Boyden小室检测鉴定其活性。[0156] 细胞单克隆及细胞池的建立
[0157] 使用Lipofectamine 2000转染试剂将pcDNA3.1-chemerin和空载体pcDNA3.1分别转入7404和SK-Hep-1细胞中。通过G418对转染的细胞进行筛选，并用Western blotting进一步鉴定抗性克隆，得到具有不同表达水平的单克隆。
[0158] 病毒表达载体和包装质粒共转入293T细胞中进行包装。按照常规方法收集包装好的病毒，感染靶细胞，分别得到了荧光素酶标记的PVTT-1 luci细胞（经分选后得到的细胞池），高表达chemerin的PVTT-1 chemerin以及对照PVTT-1con细胞池，高表达chemerin的MHCC97H chemerin及对照MHCC97H con细胞池。[0159] 体外细胞迁移实验
[0160] 细胞的迁移能力使用改进的Boyden Chamber方法进行检测。8-um孔径的聚碳酸酯薄膜（Neuro Probe）用胶原（50mg/ml溶于0.02N醋酸）4℃包被过夜，合适数量的细胞（5.0×104～1.0×105，视细胞种类而定）悬浮于100ul含1%FBS的培养基或无血清培养基中，接种于12孔Transwell（Neuro Probe）的上层孔中，下层孔中加入含10%FBS的培养基提供血清梯度，37℃孵育6～10小时（视细胞种类而定），用吸水纸去除残留在薄膜正面的细胞，伊红固定染色，在正置显微镜下拍照计数。体内肿瘤转移实验
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[0162] 使用荧光素酶标记的PVTT-1细胞。将5x10个癌细胞注射入六周大裸鼠的左心室（每组8只，分别注射空载体对照细胞以及过表达chemerin的细胞）。实验后，即通过IVIS-Imaging System验证了注射的成功性。之后每周注射荧光素酶的底物荧光素，通过IVIS-Imaging System检测细胞的转移情况。[0163] 小管形成实验（Tube Formation Assay）[0164] 在实验的前一天，将Matrigel置于4°C过夜融化。第二天，先将45ul Matrigel用冰冻过的枪头吸取，铺于96孔板中，37°C静置30分钟以上，使其凝固。消化HUVEC细胞并进行计数，按照1.2x105细胞/ml的密度，重悬于条件培养基中，混匀后，将100ul细胞
[0161]
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悬液加入已经铺有Matrigel的96孔板中，置于细胞培养箱内，37°C，5%CO2进行培养并持续观察，一般在6～8小时后即可见明显的小管形成，用显微镜进行拍照。[0165] 对THP-1细胞的诱导分化及处理
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[0166] 将THP-1细胞按照1.2x10个细胞/孔的密度铺种于六孔板中。阴性对照组用100nM的佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA，购自cell signaling）（100nM）分化三天，然后用无血清的RPMI 1640培养基（购自Gibco）培养两天；阳性对照组用PMA（100nM）分化三天，然后用含脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，购自Sigma）（100ng/ml）的RPMI1640无血清培养基培养一天；对照条件培养基（CM）组用PMA（100nM）分化两天，再用PVTT-1 con细胞的CM加上PMA（100nM）一起分化一天，然后撤去PMA，用PVTT-1 con细胞的CM孵育两天；chemerin CM组用用PMA（100nM）分化两天，再用PVTT-1 chemerin细胞的CM加上PMA（100nM）一起分化一天，然后撤去PMA，再用PVTT-1 chemerin细胞的CM孵育两天。在处理过程中，每天均更换培液，加入对应的新鲜培液。[0167] 肝内注射肝癌细胞
[0168] 采用5-6周大的裸鼠，向裸鼠腹腔注射6%水合氯醛（300mg/kg）进行麻醉。仰卧位固定，在胸骨下缘2cm处沿腹中线向上剪开皮肤约1cm，分离并剪开腹膜，暴露肝脏，轻压腹部，挤出肝脏左叶，用注射器将细胞悬液(5x105细胞/50μL)缓慢注入肝被膜下的肝实质内，针头与肝脏表面的角度尽量小，刺入深度为2～3mm，见注射部位的肝脏组织变白,即说明注射成功,将针头静息片刻，然后缓慢拨出针头,用止血棉轻压注射部位,以防出血及细胞外溢。将肝脏还回自然位置,用可吸收性外科缝线缝合腹膜及皮肤切口。用PVTT-1 con和PVTT-1 chemerin细胞进行肝内注射的小鼠各为一组，每组各有8只。[0169] 利用肝脏注射模型研究chemerin的治疗潜能[0170] 如上文所述的“肝内注射肝癌细胞”方法，我们将荧光素酶标记的PVTT-1luci细胞进行肝脏注射。在术后三天，通过注射荧光素酶的底物荧光素，经活体成像仪检测，将肝脏部位荧光信号强度相当的小鼠平均分为两组，每组10只。其中一组为对照组，以两天一次的频率腹腔注射100ul PBS，另一组为chemerin处理组，以同样的频率，按照10ug chemerin/小鼠的量腹腔注射同体积（100ul）chemerin。在chemerin处理实验期间，每周通过荧光信号对肝原位的肿瘤生长和发生的远端转移进行检测，每隔4天称量一次小鼠体重，同时记录小鼠的死亡时间。目前的数据截止到处理第六周。[0171] 组织芯片
肝癌组织芯片组由两套独立的组织芯片（1号芯片，2号芯片各为一套）组成。组
织芯片所用到的肝癌组织来源于手术切除的组织（来自于东方肝胆外科医院）。经病理学检测确认正常和肝癌组织区域后，选取相应部位的组织进行取材，构建组织阵列。本肝癌组织芯片组共选用癌旁正常组织样本60例，肝癌组织样本372例，肝癌门静脉癌栓样本33例。其中1号芯片包含正常组织样本30例，肝癌组织样本186例，肝癌门静脉癌栓样本17例，总计233个样本点；其中2号芯片包含正常组织样本30例，肝癌组织样本186例，肝癌门静脉癌栓样本16例，总计232个样本点。[0173] Western Blot
[0174] 将培养的细胞用PBS清洗，再用RIPA缓冲液在冰上裂解30分钟。将细胞裂解物于10,000g离心15分钟，取上清，用Bradford试剂(Sigma)测定蛋白浓度，使用10%或12%
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SDS-PAGE跑胶，然后将蛋白转移至Immobilon膜(Millipore，Bedford，MA)上，用特异性的抗体进行免疫印迹。所有的免疫印迹均用化学发光(Pierce)进行显影。[0175] 结果
[0176] 1．chemerinde表达的临床意义[0177] 我们对单克隆化的，具有不同转移能力的MHCC97肝癌细胞进行了微阵列分析，在表达与其转移能力呈现显著相关性的分子中，我们选取了与其转移能力呈现梯度负相关的chemerin进行研究。我们首先通过实时PCR检测了单克隆化的MHCC97细胞中chemerin的表达，结果与微阵列分析的结果一致，chemerin的表达水平随着细胞在体内转移的能力的升高而降低（图1A）。接下来，我们检测了46对配对的临床样本中chemerin的表达，结果显示，与配对的正常肝组织相比，肝癌组织中chemerin的表达在mRNA水平上显著降低（图1B）。
[0178] 此外，我们利用组织芯片染色，检测了chemerin的表达在蛋白水平上的变化。我们对组织芯片中chemerin的信号强弱进行了评分，分为4个等级，从低到高依次为0，1，2，3。如图2A和2B所示，chemerin的免疫组化染色信号几乎检测不到，或者非常微弱，评分分别为0和1。而在图2C和2D中，chemerin呈现较强或者非常显著的高表达，评分分别为2和3。
[0179] 我们结合了临床病理信息，对chemerin的表达进行了统计分析。统计分析的结果显示，当chemerin在组织芯片的评分分为0，1，2，3四个等级时，chemerin和肝癌患者的生存期具有显著正相关性，chemerin的表达越高，病人的生存期越长，chemerin的表达越低，患者的生存期越短。而当我们把0，1归为划为“0”级，把2，3划为“1”级，再进行统计分析后，chemerin与肝癌患者生存期的正相关性就更加显著了（p=0.0000724【两级划分】 [0183] 20 CN 102772782 A 说 明 书 18/21页 在我们所用的肝癌组织芯片中，有28对配对的原位肝癌和门静脉癌栓的点 （dot），对进行了免疫组化染色后的chemerin信号强度的统计表明，与相对应的原位肝癌相比，在大部分门静脉癌栓中，chemerin的表达都下调，并且具有显著的统计学差异（表2），提示chemerin的下调可能是肝癌门静脉癌栓生成和发展的必要因素。[0185] 表2：对肝癌组织芯片中28对配对的原位肝癌和门静脉癌[0186] 栓点中chemerin信号强度的分析 [0184] [0187] p*=0.014，等级“0”和“1”为前述“两级划分”中的0和1。 [0189] 2．chemerin抑制了肝癌细胞的体外迁移能力[0190] 我们检测了数株肝癌细胞系中chemerin的表达，发现除了成瘤性较弱的HepG2表达较高水平的chemerin以外，其它肝癌细胞中chemerin的表达水平非常低，很多都难以检测到。因此，我们将chemerin引入本底表达水平极低的7404，PVTT-1等细胞中。在得到具有不同的chemerin表达水平的稳定表达株（7404/v，7404/chemerin L，7404/chemerin M，7404/chemerin H；SK-Hep-1/v，SK-Hep-1/chemerin L，SK-Hep-1/chemerin H），或细胞池 [0188] 21 CN 102772782 A 说 明 书 19/21页 （PVTT-1 con，PVTT-1chemerin；MHCC97H con,MHCC97H chemerin）后，我们进行了多项检测。与对照细胞相比，高表达chemerin的肝癌细胞在增殖和凋亡方面，并没有差异，然而，Boyden小室检测的结果显示，过表达chemerin显著抑制了肝癌细胞的体外迁移能力（图3A-3D，图6A）。当我们通过RNAi下调7404/chemerin H和HepG2细胞中chemerin表达后，增强了细胞的体外迁移能力（图3E-3F、图6B），从而提示了chemerin与肝癌细胞迁移能力的密切关系。我们使用活性形式的chemerin重组蛋白对肝癌细胞进行处理，结果显示，活性形式的重组蛋白能够显著抑制细胞的体外迁移能力。而当我们使用chemerin的抗体对过表达chemerin的肝癌细胞进行处理，则能明显增强细胞的体外迁移能力（图12）。这些结果表明，chemerin对肝癌细胞迁移能力的抑制是通过分泌到细胞外的具有活性的chemerin蛋白而实现的。 [0191] 3．chemerin通过负调控Akt的活性，抑制肝癌细胞的迁移能力[0192] 为了研究chemerin影响肝癌细胞迁移能力的机制，我们对相关的信号通路进行了检测，我们发现，在高表达chemerin的肝癌细胞中，Akt的磷酸化水平发生了显著下降（图4A，图6C），而在通过RNAi对chemerin进行敲低的HepG2细胞中，Akt的磷酸化水平则明显上升（图4A）。Akt是参与调节细胞迁移的重要分子，这一结果提示，chemerin对细胞迁移的抑制作用，很可能是通过对Akt活性水平的下调而实现的。已有的研究表明，chemerin与受体结合后，会激活下游的Akt，引起Akt磷酸化水平的上升，这与我们所观察到的相反。为了解释这一分歧，我们使用了商业化的具有活性的chemerin重组蛋白对肝癌细胞分别进行了短时和长时的处理。我们发现，短时处理（15分钟）的确能够提高Akt的磷酸化水平，但是，如果进行长时处理，Akt的磷酸化水平则从30分钟后开始下降，到2小时左右降至最低，4小时后又回复（因为此时加入培养基中的chemerin已被代谢掉，如果持续加入新鲜的chemerin，仍然可维持对Akt磷酸化的抑制效果）（图4B）。因此，我们的工作揭示，长时持续不断的chemerin刺激，会抑制肝癌细胞中Akt的活性，这与它对肝癌细胞转移能力的抑制是相一致的。 [0193] 为了进一步明确Akt在chemerin所引起的对肝癌细胞迁移能力的抑制中的作用，我们将表达持续活化的Akt的质粒（CA-Akt）转入过表达chemerin的肝癌细胞中。如图13所示，持续活化的Akt能有效的逆转chemerin对肝癌细胞迁移能力的抑制，结合之前的实验结果：过表达外源chemerin的肝癌细胞中，Akt的磷酸化水平下降；用活性形式的chemerin长时处理肝癌细胞，亦会引起Akt磷酸化水平的下降。我们得出结论：chemerin通过负调控Akt的活性，抑制了肝癌细胞的迁移。此外，我们通过RNAi，在高表达chemerin的7404细胞克隆7404/chemerin H中将chemerin进行敲除，并通过FACS，筛选得到对照克隆：7404/chemerin H icon和两个chemerin的表达水平被不同程度抑制的克隆：7404/chemerin H i1和7404/chemerin H i2。Boyden小室检测的结果显示，当抑制过表达chemerin的克隆中chemerin的表达水平后，细胞被抑制的体外迁移能力得到了回复，且其回复程度和chemerin表达的抑制程度呈剂量依赖性的关系（图6）。同时，Akt磷酸化的水平也回升了，与体外迁移能力回复的趋势一致。这一结果证明了chemerin的确通过调控Akt的磷酸化水平和活化程度，影响了肝癌细胞的体外迁移能力。 [0195] 4．chemerin通过抑制VEGF启动子区域的转录活性，下调VEGF的mRNA和蛋白水 [0194] 22 CN 102772782 A 说 明 书 20/21页 平 肿瘤细胞在体内的转移受到多种因素的影响。除了肿瘤细胞本身的迁移能力外， 肿瘤细胞对血管生成的影响，也是关键的因素，决定了转移灶的形成及发展。VEGF是调控血管生成的关键分子，因此，我们检测了chemerin对肝癌细胞中VEGF表达的影响。我们发现，高表达chemerin对于VEGF的mRNA及蛋白水平都有显著的抑制作用（图5A-5B，图6C）。而且，小管形成实验的结果显示，相比于对照细胞，高表达chemerin的肝癌细胞的条件培养基对于HUVEC细胞的体外成血管能力具有明显的抑制作用（图5C，图7A）。而当我们将7404/chemerin H中的外源chemerin进行knockdown后，7404/chemerin H i1和7404/chemerin H i2的条件培养基与对照细胞的条件培养基相比，显著提高了HUVEC的成血管能力（图7B），而chemerin RNAi克隆的VEGF蛋白水平也相应升高了（图6C）。这些结果提示，chemerin不仅直接抑制肝癌细胞的转移能力，而且，chemerin的存在，也会对肝癌的发展及转移过程中的血管生成起到抑制作用，这与chemerin在肝癌细胞中的下调是一致的，进一步支持和证明了chemerin在肝癌中所扮演的抑癌分子的角色。[0197] 为了进一步探索相关机制，我们使用包含了VEGF启动子区域的荧光素酶报告基因载体进行了检测。如图14所示，在三种不同的肝癌细胞中，chemerin均能显著下调VEGF启动子的荧光素酶活性，这表明chemerin是通过抑制VEGF启动子的转录活性，从而下调其mRNA的水平，这与上述发现是一致的。 [0196] 5．chemerin抑制了肝癌细胞在体内的远端转移和肝内转移[0199] 我们利用左心室注射模型，检测了chemerin对肝癌细胞远端转移能力的影响。实验结果表明，过表达chemerin导致肝癌细胞在体内远端转移能力的下降（图8A）。[0200] 由于肝癌组织芯片染色的结果提示，chemerin和肝癌门静脉癌栓的生成和发展之间存在显著的相关性，因此，我们采用了肝内注射这一倾向于肝内转移的模型，以研究chemerin对肝内转移的影响。 5 [0201] 我们将同等数量的用荧光素酶标记的PVTT-1 con和PVTT-1 chemerin（5x10个细胞）注射入裸鼠的左肝叶，然后每周注射底物，检测荧光信号。在手术8周后，将两组实验小鼠处死，解剖，对肝表面白色的癌灶（foci）进行计数（分为注射叶和非注射叶/转移叶），然后将肝脏固定，用石蜡包埋，切片，进行HE染色。如图8C所示，对肝脏表面的癌灶计数结果表明，在PVTT-1con组中，无论是注射叶，还是非注射叶/转移叶，癌灶数量都远远超过PVTT-1chemerin组。图8B的照片显示了具有代表性的，表面呈现众多白色癌灶的PVTT-1 con组中小鼠的肝脏，以及除了注射叶有明显的白色原发灶，在表面的其它部分都鲜见癌灶的PVTT-1 chemerin组中小鼠的肝脏。所示肝脏相对应的切片的HE染色结果显示，在PVTT-1 con组小鼠的肝脏内部，有许多粉色的，和周围显示出正常肝实质细胞形态不一样的癌灶，即为白色癌灶在切片上的染色结果体现。而PVTT-1 chemerin组小鼠的肝脏内部，呈现均一的正常肝实质细胞组成，鲜见癌灶形成，这与我们所观察到的几乎正常的肝脏表面情况是一致的（图8B）。这些数据都表明，chemerin有效的抑制了肝癌细胞的肝内转移。 [0202] 6．chemerin诱导肝癌微环境中巨噬细胞向M1型极化[0203] chemerin是作为趋化因子被发现和报道的，而chemerin对巨噬细胞的招募作用，在对它的研究之初就被揭示。我们的研究探索了chemerin对巨噬细胞亚型的影响。我们 [0198] 23 CN 102772782 A 说 明 书 21/21页 分别用对照细胞和高表达chemerin的肝癌细胞的条件培养基对已诱导分化为巨噬细胞的THP-1细胞进行处理。通过实时PCR，我们检测了M1型巨噬细胞的标记分子TNF-alpha，IL-6，IL-12a的表达，以及M2型巨噬细胞的标记分子CCL24的表达。如图9所示，与对照细胞的条件培养基处理相比，过表达chemerin的肝癌细胞的条件培养基能显著促进M1型巨噬细胞的极化。同时，抑制M2型巨噬细胞的极化。由于M1型巨噬细胞具有肿瘤杀伤的效应，而M2型则具有促进肿瘤发生发展的作用。因此，这一结果提示，chemerin可以通过改变肝癌细胞的分泌谱，促进微环境中肿瘤杀伤型M1巨噬细胞的极化，从而促进抑癌微环境的生成，这是chemerin在肝癌中的抑癌作用在肿瘤微环境方面的体现。 [0204] 7．利用纯化所得到的活性形式的chemerin蛋白和肝内注射的小鼠模型，探索将chemerin应用于肝癌治疗的可能性 [0205] 我们借鉴了Xiang D et al.的方法（Expressions and purification of a mature form of recombinant human chemerin in Escherichia coli.Protein Expr.Purif.2010;69(2):153-8），并根据自身的实验条件进行了改善和优化（见前文材料与方法部分），纯化得到了具有生物学活性的成熟的chemerin重组蛋白（图10A）。如图10B所示，当用纯化得到的蛋白进行长时处理时，可以在较长时间内对Akt的磷酸化水平进行抑制。[0206] 如图11所示，与PBS对照相比，chemerin处理显著延长了肝脏荷瘤小鼠的生存时间，并且，也有效缓解了肝癌发展所带来的体重减轻，这都表明chemerin具有应用于肝癌治疗的巨大潜力。[0207] 8．chemerin和chemerin-9对肝癌细胞转移能力和Akt磷酸化水平抑制作用的比较 [0208] 据文献报道，chemerin C-ter的9肽亦可结合并激活ChemR23。因此，我们根据文献（Wittamer V et al.,The C-terminal Nonapeptide of mature chemerin activates the chemerin receptor with low nanomolar potency,J Biol.Chem.2004,12;279(11):9956-62），委托上海爱柏生物科技有限公司合成了chemerin的C末端9肽序列（149YFPGQFAFS157，chemerin-9），并根据前述方法在体外检测了它对肝癌细胞迁移能力以及Akt磷酸化水平的影响。如图15所示，我们发现，和活性形式的chemerin蛋白相比，相同浓度的chemerin-9也可在一定程度上抑制肝癌细胞的迁移能力以及Akt的磷酸化。 [0209] 尽管以具体实施方式的形式描述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明做出各种修改和变动，这些修改和变动都在本发明的保护范围之内。 24 CN 102772782 A序 列 表 [0001] [0002] 25 1/12页 CN 102772782 A [0003] 序 列 表 26 2/12页 CN 102772782 A 序 列 表 3/12页 [0004] 27 CN 102772782 A [0005] 序 列 表 28 4/12页 CN 102772782 A [0006] 序 列 表 29 5/12页 CN 102772782 A 序 列 表 [0007] 30 6/12页 CN 102772782 A [0008] 序 列 表 7/12页 31 CN 102772782 A 序 列 表 8/12页 [0009] 32 CN 102772782 A 序 列 表 9/12页 [0010] 33 CN 102772782 A 序 列 表 10/12页 [0011] 34 CN 102772782 A [0012] 序 列 表 11/12页 35 CN 102772782 A 序 列 表 12/12页 36 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 1/13页 图1 37 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 2/13页 图2 38 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 3/13页 图3 39 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 4/13页 图4 40 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 5/13页 图5 41 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 6/13页 图6 42 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 7/13页 图7 43 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 8/13页 图8 44 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 9/13页 图9 45 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 10/13页 图10 图11 46 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 11/13页 图12 图13 47 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 12/13页 图14 48 CN 102772782 A 说 明 书 附 图 13/13页 图15 49 因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容