DZNep对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的抑制作用

张乐;李庆华;杨璐;朱立强;张彦婷;关方霞

【摘 要】目的:探讨EZH2抑制剂DZNep对裸鼠Eca109细胞移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法:将Eca109细胞接种于15只裸鼠右侧背部皮下构建裸鼠移植瘤模型后分为3组,每组5只,其中2组分别腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-FU)、DZNep治疗2周,另外1组腹腔注射生理盐水作为对照组.观察肿瘤生长情况,采用Western blot检测肿瘤组织中EZH2、SAHH、组蛋白甲基化相关蛋白及mTOR/p70S6K信号通路相关蛋白、Caspase-3、E-cadherin的表达情况,并通过TUNEL法检测肿瘤组织中细胞的凋亡,计算细胞凋亡率.结果:DZNep组肿瘤块质量小于对照组(P＜0.05).与对照组比较,DZNep组肿瘤组织中Caspase-3和E-eadherin表达水平增高,细胞凋亡率升高(P＜0.05).另外,与对照组相比,DZNep组H3 K27 me3表达降低,PTEN表达升高,mTOR和p-p70S6K表达均下降(P＜0.05).结论:DZNep可抑制食管鳞癌移植瘤增长,并诱导肿瘤细胞凋亡;其机制可能是通过对EZH2的抑制增强PTEN的表达,从而抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活.%Aim:To observe the effects of DZNep on the growth of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) xenograft and mTOR/p70S6K signaling pathway in vivo.Methods:Eca109 cells were injected into 15 nude mice to establish Eca109 cell xenograft mouse model.These 15 mice were

randomly allocated into 3 groups.Mice in one group were intraperitoneally injected with 5-FU every other day for 2 weeks,mice in one group were injected with DZNep,and mice in the last group were injected with normal saline as control.Then,Western blot was employed to detect the expressions of EZH2,SAHH,histone methylation related

protein,mTOR/p70S6K signal pathway related protein,Caspase-3,and E-cadherin in tumor tissue.And TUNEL was used to detect the cell apoptosis in tumor.Results:The tumor weight was decreased significantly in DZNep group compared with that in control group (P ＜ 0.05).Meanwhile,the expression of Caspase-3 and Ecadherin and the apoptosis rate were increased significantly in tumor tissue of DZNep group(P ＜ 0.05).The expression of PTEN was increased,and the expressions of H3K27me3,mTOR and phosphorylated p70S6K were decreased in DZNep group(P ＜

0.05).Conclusion:DZNep could inhibit ESCC xenograft growth and promote ESCC cell apoptosis in vivo,by inhibiting the activation of mTOR/p70S6K signal pathway.

【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》 【年(卷),期】2018(053)001 【总页数】5页(P17-21)

【关键词】食管鳞癌;EZH2抑制剂;DZNep;裸鼠;mTOR/p70S6K信号通路 【作 者】张乐;李庆华;杨璐;朱立强;张彦婷;关方霞

【作者单位】郑州大学生命科学学院 郑州450001;郑州大学生命科学学院 郑州450001;郑州大学生命科学学院 郑州450001;郑州大学第二附属医院检验科 郑州450014;郑州大学生命科学学院 郑州450001;郑州大学生命科学学院 郑州450001

【正文语种】中 文

【中图分类】R735.1

食管鳞癌是发展中国家的主要食管癌类型，在世界范围的食管癌患者中约占95%，全球每年新增约50万例食管癌患者，其中一半以上发生在中国，尤其是河南、河北和山西三省交界的太行山区[1]。目前，化学治疗仍是食管癌常规治疗的主要方法之一。但是，长期使用化疗药物往往会造成肿瘤细胞的耐药性。DZNep最初被认为是通过抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)活性来抑制S-腺苷-甲硫氨酸依赖的甲基化反应，最近的研究[2]发现它能通过抑制组蛋白甲基转移酶 EZH2诱导肿瘤细胞的凋亡。EZH2可以特异性地使组蛋白H3的第27位点的赖氨酸(H3K27)三甲基化(H3K27me3)，从而使下游靶基因沉默。近年来，EZH2被认为是一种致癌基因，EZH2过表达与肿瘤的发生和发展密切相关[3-4]。因此，DZNep作为EZH2的小分子抑制剂，因其对肿瘤潜在的治疗作用而受到关注[5-9]。前期研究[10]发现，DZNep能抑制食管鳞癌细胞Eca109的增殖，促进其凋亡。为了进一步探究DZNep对食管鳞癌的治疗作用，作者观察了DZNep对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的抑制作用，现将结果报道如下。 1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 食管鳞癌细胞株Eca109购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，DZNep购自美国Selleck公司，5-氟尿嘧啶(5-FU)购自美国Sigma公司，标准胎牛血清(FBS)购自天津灏洋生物制品有限公司，胰蛋白酶及RPMI 1640培养基均购自美国 HyClone 公司，Caspase-3、内参GAPDH多克隆抗体及组织蛋白提取试剂盒均购自上海生工生物技术服务有限公司，E-cadherin、SAHH多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，H3K27me3、总组蛋白和PTEN等抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。

1.2 细胞培养与裸鼠饲养 Eca109细胞培养于含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基中，置于含体积分数5% CO2的培养箱内37 ℃培养，每隔1 d传代1次。BALB/c裸鼠，6周龄，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重25～30 g，饲养于河南省实验动物中心，饲养条件达到SPF级。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立及实验分组 15只新购裸鼠在适应7 d后开始进行实验，取对数生长期Eca109细胞接种于裸鼠右侧背部皮下，每只裸鼠接种 200 μL细胞悬液(3×107 mL-1)，10 d后将裸鼠采用随机数字表法分为3组，每组5只。对照组：腹腔注射生理盐水，隔天注射1次，持续2周；DZNep组：按照1 mg/kg腹腔注射DZNep，隔天注射1次，持续2周；5-FU组：按照5 mg/kg腹腔注射5-FU，隔天注射1次，持续2周。药物处理后开始隔天测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。第13天测量完毕后处死裸鼠，取出肿瘤并称量。 1.4 Western blot法检测肿瘤组织中mTOR/p70S6K信号通路相关蛋白、黏附因子、总组蛋白的表达情况 将收集的肿瘤组织标本按试剂盒说明书提取总蛋白，定量后SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离，采用湿转法将目的蛋白转至PVDF膜上，封闭2 h后加入一抗(SAHH、EZH2、E-cadherin、Caspase-3、H3K27me3、总组蛋白、PTEN、mTOR、p-p70S6K)，4 ℃孵育过夜，然后在二抗溶液中孵育1 h，清洗后加入ECL超敏发光液进行化学发光显色，结果使用Image J进行分析。 1.5 TUNEL法测定肿瘤细胞的凋亡情况 裸鼠肿瘤组织石蜡包埋、切片，经脱蜡、促渗、通透、封闭后按照说明书进行操作。200倍显微镜下观察，棕色为凋亡细胞。细胞凋亡率=(凋亡细胞数/肿瘤细胞总数)×100%。

1.6 统计学处理 采用SPSS 21.0进行数据分析。不同组间裸鼠瘤块体积的比较采用重复测量数据的方差分析；不同组间裸鼠肿瘤块质量、细胞凋亡率、黏附因子、总组蛋白、mTOR/p70S6K信号通路相关蛋白表达的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DZNep对Eca109细胞在各组裸鼠体内增殖的影响 15只裸鼠均荷瘤成功，成瘤率100%，肿瘤生长情况见图1和表1、2。可以看出，与对照组相比，从处理后第7 天开始5-FU组与DZNep组瘤块体积减小。

图1 各组裸鼠第13天瘤块生长情况表1 各组裸鼠瘤块体积比较 mm3组别n第1天第3天第5天第7天第9天第11天第13天对照组5100．33±17．24293．18±31．82284．12±44．83395．16±28．92546．41±50．32724．87±91．20874．29±82．065⁃FU组

5109．46±17．53221．92±27．22208．73±21．10262．29±22．38∗305．87±35．23∗434．17±21．85∗504．12±27．64∗DZNep组

595．16±16．34216．20±37．67209．13±30．90259．06±27．56∗325．64±35．23∗410．30±37．58∗498．06±24．24∗

F组间=8.643，P=0.007；F时间=14.776，P<0.001；F交互=13.024，P<0.001；*：与对照组相比，P<0.05

表2 各组裸鼠肿瘤块质量比较 g组别n肿瘤块质量对照组

50．624±0．0235⁃FU组50．344±0．015∗DZNep组50．372±0．043∗ F=26.770,P<0.001;*：与对照组相比，P<0.05

2.2 DZNep对肿瘤组织中EZH2和SAHH蛋白表达的影响 结果显示，与对照组和5-FU组相比， DZNep组EZH2蛋白表达降低(图2、表3)。

图2 各组裸鼠肿瘤 组织中EZH2和SAHH蛋白的表达表3 3组裸鼠肿瘤组织中各蛋白表达情况

组别nEZH2SAHHCaspase⁃3E⁃cadherinH3K27me3总组蛋白PTENmTORp⁃p70S6K对照组

50．60±0．110．88±0．200．56±0．040．56±0．030．83±0．040．53±0

．110．36±0．150．66±0．091．17±0．085⁃FU组

50．67±0．12#0．90±0．100．91±0．02∗0．78±0．02∗0．86±0．10#0．55±0．100．43±0．11∗#0．61±0．05∗#1．06±0．05∗#DZNep组

50．32±0．11∗0．86±0．110．92±0．10∗0．72±0．02∗0．50±0．12∗0．56±0．040．82±0．14∗0．30±0．09∗0．70±0．11∗F171．9804．910112．67061．980139．2704．630161．770126．71019．510P<0．0010．055<0．001<0．001<0．0010．061<0．001<0．0010．002 *：与对照组相比，P<0.05;#:与DZNep组相比，P<0.05

2.3 DZNep对肿瘤组织中细胞凋亡、黏附蛋白表达的影响 结果见图3、4和表3、4。可以看出，与对照组比较，DZNep组和5-FU组Caspase-3表达水平升高，细胞凋亡率增加，黏附蛋白E-cadherin表达水平升高。 图3 各组裸鼠肿瘤组织中Caspase-3、E-cadherin蛋白的表达

A：对照组；B：5-FU组；C：DZNep组图4 各组裸鼠肿瘤组织中细胞凋亡的检测结果(TUNEL，×200)表4 各组裸鼠肿瘤组织中细胞凋亡率的比较 % 组别n细胞凋亡率对照组50．72±1．105⁃FU组536．56±1．05∗DZNep组541．19±3．17∗

F=65.570,P<0.001;*：与对照组相比，P<0.05

2.4 DZNep对肿瘤组织中m-TOR/p70S6K信号通路相关蛋白表达的影响 结果见图5、表3。可以看出，与对照组和5-FU组相比，DZNep组中总组蛋白表达不变，H3K27me3表达下降，PTEN表达增加，m-TOR和p-p70S6K表达降低。 图5 各组裸鼠肿瘤组织中 mTOR/p70S6K信号通路相关蛋白的表达 3 讨论

多年来，手术、放化疗等食管癌的治疗方法取得了巨大的进展，但其术后5 a总体生存率不足20%，因此寻找食管鳞癌有效的靶向治疗成为研究热点。EZH2是组

氨酸-赖氨酸-N-甲基转移酶，在多种肿瘤组织中异常高表达，它可以使多个抑癌基因表达沉默，其中包括促凋亡基因及抑制细胞增殖的基因，从而促进肿瘤的生长[11-12]。该研究使用EZH2抑制剂DZNep对Eca109荷瘤裸鼠进行治疗，结果显示，DZNep能显著抑制肿瘤组织中EZH2蛋白的表达，从而抑制了其对H3K27的甲基化作用。前期研究[13]发现，DZNep能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109的增殖，促进其凋亡。该研究进一步证实DZNep能有效抑制食管鳞癌细胞的生长，增强其黏附性，并促进其凋亡，DZNep与5-FU有相当的效果。 雷帕霉素靶蛋白信号通路在肿瘤发生发展中起重要作用。研究[14]发现，mTOR/p70S6K信号通路在食管鳞癌细胞中异常激活。PTEN位于mTOR/p70S6K信号通路的上游，它能通过磷酸化PIP3，负性调节

mTOR/p70S6K信号通路。还有研究[15]发现，在食管鳞癌组织中PTEN甲基化，从而导致PTEN蛋白的低表达。该研究发现，DZNep能促进PTEN表达，抑制mTOR和p70S6K表达，说明DZNep能通过促进PTEN的表达而抑制mTOR/p70S6K信号通路活性。

综上所述，DZNep可能是通过抑制EZH2来抑制mTOR/p70S6K信号通路，从而抑制食管鳞癌细胞生长。该研究结果提示，DZNep可能成为靶向抑制EZH2的食管鳞癌的治疗药物。 参考文献

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