细胞学技术在药理与毒理学研究中的应用

吴彩霞，刘朝明。岳磊，陈朝喜　华南农业大学兽医学院．广东广卅ｌ　５１０６４２　现代药理与毒理研究已不仅仅局　一限于简单的整体动物实验，而是越来　、原代肝细胞培养技术　熟，并已广泛用于药物研究。作为研究　工具，可在细胞水平上提供吸收、代谢、　越深入到细胞和分子水平，从而能从　原代肝细胞培养作为一种体外模　转运等综合信息，　为药物安全性评价，　蛋白质、酶、受体、分子通道及遗传　型，有其突出的优点：与体内情况保　临床合理用药等提供了重要和理想的　因素等多方面更深层次地了解和分析　持了一致，酶量和辅助因子的水平都　体外模型和有效体外分析手段，目前成　药物与机体相互作用的机制。因此，　是正常的生理浓度，可以在接近生理　为体外药物实验的“金标准”，广泛应　各种先进的实验技术应运而生并应用　状态的情况下研究药物的代谢及毒性；　用于药物代谢和毒理学研究中。　到药物的研究开发中来。本文针对部　较好保留和维持了肝细胞的完整形态　（一）原代肝细胞培养在药物代谢　分具有代表性的细胞学技术如原代肝　和肝细胞体外代谢活性，真实反映了　中的应用　原代肝细胞培养为药物生　细胞培养技术、微核试验、胚眙干细　体内的代谢情况；排除了其他器官，　物转化途径的研究，寻找药物可能的　胞实验、Ｃａｃｏ一２细胞模型等在药物遗　组织的影响。因而利用肝细胞无疑较　代谢物提供了一个简单和有效的模型。　传毒性以及代谢研究领域中的应用特　其他细胞更具说服力。随着技术水平　通过药物和原代肝细胞的孵育，可以　点和现状进行了概述。与一用　　的不断提高，原代肝细胞培养越来越成　得到相对多量和高纯度的代谢物，减　（接上页）错重叠覆盖在脂质体表面，　为免疫脂质体。脂质体对靶细胞分子　适用于静脉给药或用于其它给药途径。　形成的构象云。这种立体保护作用取　水平上的识别能力，取决于其表面所　这种瞻质体解决了稳定性和高温灭菌　决于聚合物的柔性，位阻保护晤质体　连接的识别分子的结合特异性。将抗　等问题，为工业化生产奠定基础。前　不被血液中的调理素识别、摄取，从　体结合于脂质体表面形成免疫惰质体，　体瞻质体在抗肿瘤方面将有可能成为　而使脂质体清除速率减慢，血液中驻　有可能负起这种职责，特别是应用杂交　化疗的重要手段。　留时间延长，使药物作用时间延长。　瘤技术成功地获得具有高纯度抗体即　因此，长循环脂质体作为药物载体应　单克隆抗体（ＭｃＡｂ）原的靶细胞有特　四、结语　用于临床特别是肝、脾以外组织或器　异性结合。当以抗癌细胞ＭｃＡｂ结合　脂质体及其稳定性研究涉及到多　官的靶向性给药，町延长脂质体的体　到脂质体上，体内外试验证明能选择性　种因素，多个领域。要制备稳定有效　内循环时间，延缓药物的释放率，为　地与抗原阳性地癌细胞结合并杀伤之。　的脂质体，不但要控制多种因素，更　机体的持续靶向给药提供了方便，将　５．前体脂质体：采用的冷冻干燥　重要的是要从根本上弄清影响脂质体　获得良好的治疗效果。研究证明米托　方法制备前体脂质体，能批量生产脂　稳定性机制，建立评价脂质体稳定性　蒽醌长循环脂质体有效地延长血循环　质体并长期保存成为商品。经冷冻干　的可靠方法和参数。随着各学科研究　时间，提高靶向效率。　燥制成具有良好流动性能颗粒或粉末　的进一步深入，脂质体将会呈现其巨　２．免疲脂质体：掺入抗体形成被　的前体脂质体，应用前与水水合即可　大的优势和应用潜力。　抗体修饰的具有免疫活性的脂质体称　分散或溶解成等张的脂质体混悬液，　（参考文献略）　●ｌ口　新闻热线（１３　１　１３）８７７５５３８Ｓ｛ｉ￣ｊ　１　３　订阅服务（１３　１　３１）臼７７５５］曰５转１　７　投稿信箱５　ｄｋ己口口７＠己６］－ｌｌｅｔ　重庆维普 http://www.cqvip.com

少了许多外界因素的干扰。近几年，　文献报道得较多的是鼠及猪的原代肝　提高，对ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６却无影　短；细胞色素Ｐ４５０酶的活性下降过快。　响；但是金丝桃素对ＣＹＰ３Ａ４无影响。　原代培养肝细胞已成为检测中草药产　物对ＣＹＰ４５０酶影响的体外通用模型。　Ｓａｈｉ等应用人原代肝细胞和大鼠原　尽管如此，原代培养肝细胞依然广泛　应用于药物研究的许多方面，为研究　细胞，但是药物代谢及ＣＹＰ４５０系统　存在显著的种属差异，人与小鼠、大鼠、　兔子、狗之间无论从ＣＹＰ４５０的总量、　药物代谢途径，寻找药物在体内的代　谢物，阐明药物对细胞色素Ｐ４５０酶的　作用及其机制，解决种属差异的困扰，　各亚型的结构、比例、命名及构效关　系都存在着不同。　２００１年Ｗａｔｋｉｎｓ等在Ｓｃｉｅｎｃｅ上　代肝细胞来研究治疗非胰岛素依赖型　糖尿病的药物曲格列酮，发现曲格列　酮诱导了人的ＣＹＰ３Ａ４和ＣＹＰ２Ｂ６，　了解药物的细胞毒性和遗传毒性等提　供了Ｅｔ益重要的体外模型。　指出核受体孕烷受体（ｐｒｅｇｎａｎｅ　Ｘ　但对ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２没有什么　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＸＲ）对细胞色素Ｐ４５０酶　３Ａ亚型的调节起核心作用。由于ＰＸＲ　在机体适应环境中的重要作用，它已　成为药理学、生理学等学科研究的热　点。原代肝细胞中维持了很好的ＰＸＲ　的水平，为研究ＰＸＲ与ＣＹＰ４５０酶　特别是ＣＹＰ３Ａ４的关系，探讨药物代　谢机制，阐述在药物相互作用中所发　挥的作用提供了可靠的依据。Ｄｅｓａｉ等　发现４一羟泰米芬可激动原代肝细胞　中ＰＸＲ受体，进而诱导了ＣＹＰ３Ａ４，　其表达增加会影响其他经ＣＹＰ３Ａ４代　谢的药物，产生药物相互作用，降低　了其他药物的疗效或加重了其他药物　的不良反应。Ｒａｕｃｙ使用原代肝细胞　发现许多天然药物作用于ＰＸＲ从而　影响ＣＹＰ３Ａ４的表达，他检测了几种　黄酮类化合物对ＣＹＰ４５０酶的诱导能　力，发现只有槲皮素增加了ＣＹＰ３Ａ４　的基因表达，但其诱导机制不是通　过ＰＸＲ受体；而利福平、苯巴比妥、　ｋａｖａ２ｋａｖａ等则是必须通过ＰＸＲ才能　诱导ＣＹＰ３Ａ４酶；这些结果暗示了西　药和中草药之间相互作用存在的可能　性。Ｇｅｒｂａｌ２Ｃｈａｌｏｉｎ等在原代肝细胞　中发现了糖皮质激素受体，ＰＸＲ和另　一种核受体ＣＡＲ参与了对ＣＹＰ２Ｃ９　基因表达的调节。　Ｂｅｒｎａｒｄ等研究了在美国最为常　用的中草药Ｓｔ．Ｊｏｈｎ　ｓＷｏｒｔ（金丝　桃素）在原代肝细胞中的诱导和抑制，　结果显示Ｓｔ．Ｊｏｈｎ　Ｓ　ｗｏｒｔ中的贯叶　金丝桃素对ＣＹＰ３Ａ４和ＣＹＰ２Ｃ９的基　因表达，蛋白含量和酶活性均有显著　影响；对大鼠而言，曲格列酮诱导　二、微核试验　了ＣＹＰ３Ａ１及ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２，　微核的形成是细胞受遗传毒物作　对ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２没有影响。　用后的一种遗传学终点，因此，微核　Ｋｏｍｏｒｏｓｋｉ等应用原代肝细胞研究了　试验在对外来化合物遗传毒性检测方　Ｓｔ．Ｊｏｈｎ　ｓＷｏｒｔ中的贯叶金丝桃素对　面，得到了广泛应用。目前常用作微　紫杉醇代谢的影响，结果表明利福平　核试验的细胞来源主要有鼠骨髓、外　诱导紫杉醇的代谢达到７～３２倍，贯　周血红细胞和肝细胞，人外周血淋巴　叶金丝桃素诱导紫杉醇的代谢呈剂量　细胞、口腔粘膜细胞和上皮脱落细胞　依赖性，最高达到３～７倍，并且出　等。微核试验最大的优点是经济、简单、　现了２个尚未确证的代谢物。　快速，无需更多的专业知识就可得到体　（二）原代肝细胞培养在毒理学中　内相关代谢效应的信息。而国外大量对　的应用　原代肝细胞培养已用于毒理　比试验研究的结果，较一致的看法是其　学研究的很多方面，其中较为重要的　敏感性、特异性和准确性方面，与经典　就是结合细胞功能和细胞毒性的研究　的染色体畸变分析方法基本相当。　方法来研究药物肝脏毒性的机制。当　所需检测的都是结构相关的化合物　三．胚胎干细胞实验　时，原代肝细胞是一个较好的筛选模　胚胎干细胞是一种多能干细胞。　型。肝脏毒性化合物，尤其是那些需　由于胚胎干细胞分化程度低，比成体　要经过生物转化才引起细胞损伤的化　干细胞的可塑性更强，因此在药理、　合物，对体外的大鼠肝细胞或者人类　药效、毒理等方面具有广泛的应用前　肝细胞往往比对非肝脏细胞的毒性要　景。目前，胚胎干细胞已被确认为是　大。Ｂｕｒｋｅｙ等利用从Ｆ３３４老鼠和　体外发育毒理学研究的可靠供试源。　Ｂ６Ｃ３Ｆ１老鼠中新鲜分离的肝细胞研究　胚胎干细胞试验借助胚胎干细胞系检　了甲基丁香油吩和樟脑素在啮齿类动　测化学物的胚胎毒性，是目前唯一一　物上的细胞毒性和遗传毒性，并指出　个利用细胞系非怀孕动物、并可替代　其机制是由硫转移酶所介导的ＤＮＡ体　检测发育毒性哺乳动物试验的体外试　外合成。Ｙａｎ等利用原代大鼠肝细胞　验。胚胎干细胞首次运用于药理、毒　证实了氧化损伤是四氯化碳诱导肝毒　理的研究是用鼠胚胎干细胞衍生的心　性的主要机制之一。　肌症模型来检测心血管药物的变时性　（三）缺陷　虽然原代肝细胞培养　活性，现在则更多地用来检测受试物　在药理及毒理学研究上有着无可比拟　的胚胎毒性和致畸性。　的优点，但是同样存在着一定的缺陷：　相对于体内实验，采用胚胎干细　灌流手术极为复杂；分离消化过程需　胞来评价受试物的胚胎毒性有着不可　在短时间内完成；肝细胞存活时间较　比拟的优势。主要表现在：更准确地　兽医导刊　己口口７年第７期　总第１１　９期・Ｉａ　重庆维普 http://www.cqvip.com

历砒m妇祝似m协何H预测细胞毒性。可较好地替代哺乳动的口服药物制剂，并对其进行安全性。野生生物的潜在危害，用体外肝细胞物实验，定性、、定量地反映毒物对细，评价等方面是很有力的工具目前，培养进行体外环境雌激素的筛选以及作用机理的研究，胞的生长分化和生物学行为的影响由于大部分中药的具体吸收成分和机特别是原代肝细胞大大减少了毒物筛选的周期和经费具有实验时间短、，制还未明确在中药：13，因此，Caco2细胞模型培养用于具有种属特异性环境雌激素以及环境致癌物的研究，高精度。、高通量检服吸收研究方向具有极为广。将会是一种测和评价的特点等泛的应用前景行之有效的方法。虽然利用胚胎干细胞系检测化学物的毒性有许多优点，但要使该项技五、展望与探讨同时究，，中药中相畏相反的配伍研，对中药复方的开发，有着及其重术在毒理学研究领域得到更好地运用仍需解决一体外细胞试验等生物技术由于其要的意义工而细胞培养以及CYP同，些技术难题。例如，如何高通量特点一、高精度、快速以及平行性的酶的研究恰恰成为其有利的工具，。对胚胎干细胞进行有效的分离和纯化；如何维持干细胞在体外进行扩增的同，已成为生物医学研究领域中的，有机利用这些实验技术对中药的现。项先进实用的技术。具有很高的应代化研究将有极大的促进作用如果能把caco时不分化；如何诱导干细胞定向分化。用价值毒理学的研究必定要深入到。2细胞模型与原代细胞及分子水平中药(尤其是其复方，肝细胞培养联合应用干药物的首过效应、四Caccolona、Caco2细胞模型thece制剂)成分复杂uman应用传统方法评价，药物的相互作用以及生物利用度，o2细胞系(ah中药的遗传毒性十分困难代细胞学技术，而借助现的研究果，将会有与体内研究接近的效denocarcinom，lllines)来从细胞水平上对药物、特别是用于人及濒危野生动物和、源于结肠癌及直肠癌普通培养条件在体外进行准确性评价，快速、高效的安全名贵犬种马种的新药开发，由于其，下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自发的分化为肠上皮细胞单层，使得我们能从微观角度更好避免了种属间药物代谢的差异实验动物，节省因此可以Caco地了解中药遗传毒性的作用靶点及其作用机制。因而可能对新药开发以及。模拟体内小肠上皮细胞层。2细环境内分泌干扰物是雌激个体化用药具有重要的意义(参考文献略)胞模型是目前国内外广泛应用的体外吸收模型，素样和抗雄激素化学物对人体健康和已迅速发展成为研究药物，吸收的必备手段并已获美国。FDA批准用作药物筛选模型Cacoco2细胞模2型具有以下优点：用Ca细胞模型可以分别研究药物从AP侧(apiscalide)的摄入侧(baso，在细胞中的滞留代谢及lateraBLlside)的外排等过程，因此对阐明药物在小肠中的吸收，机制是十分有用的做到这些；动物实验则无法，条件容易控制，数据重复。性女子；与动物实验相比更省时和经济值得关注的是，用Caco2细胞来研究中药复杂成分的吸收有助于中药有效成分的了解。Caco2细胞模型在中药吸收方面的研究热点目前主要集中在对黄酮类化合物及生物碱吸收机制的研究，对强心苷、香豆素、皂苷及Caco，萜类化合物的研究也有报道。2细胞模型在阐明药物吸收机制体内吸收相互作用●la参、预测代谢和药物特别是中药的，设计具有更高生物利用度8776538％~13新闻热线(O1O))1111％(01110)8776s3as~I17投稿信箱5uclk2007@263_几et