血清 GSTP1基因甲基化定量分析在肝细胞癌的早期诊断价值

国际检验医学杂志２０１４年３月第３５卷第５期Ｉｎｔ　Ｊ　ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ　２０１４，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．５　・临床检验研究论著・　血清ＧＳＴＰ１基因甲基化定量分析在肝细胞癌的早期诊断价值　冉贵萍　。，杨国珍　，方　文　，袁　勇　，张瑞霞　（１．上海交通大学医学院附属第九人民医院奉城分院，上海２０１４１１；　２．贵阳医学院附院生化科，贵州贵阳５５０００４）　摘　要：目的　建立实时荧光定量甲基化方法研究肝细胞癌（ＨＣＣ）患者外周血血清中游离谷胱甘肽一硫转移酶Ｐ１基因　（ＧＳＴＰ１）启动子区域甲基化状态，探讨其是否可作为ＨＣＣ早期诊断的指标。方法收集９５例血清标本，包括４Ｏ例ＨＣＣ、３Ｏ例　肝硬化和２５例健康体检者，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对血清中ＧＳＴＰ１基因的甲基化水平进行　定量分析，应用接受者操作特性（ＲＯＣ）曲线评估其诊断价值。结果　肝癌患者血清中ＧＳＴＰ１基因甲基化定量水平明显高于健　康对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＲＯＣ曲线分析表明通过ＧＳＴＰ１基因甲基化定量分析能够高效区分肝癌和肝硬化及　健康者（ＡＵＣ＝０．８６４　１），以甲基化率２　作为诊断ＨＣＣ的临界值，其诊断特异度为８７．５　，敏感度达６９．６％；联合检测血清　ＧＳＴＰ１基因甲基化和血清ＡＦＰ可将ＨＣＣ检出率提高至７５　。结论　实时荧光定量甲基化方法可精确定量血清中ＧＳＴＰ１基　因甲基化水平，在ＨＣＣ的早期诊断中有一定的应用价值。　关键词：癌，肝细胞；　谷胱甘肽转移酶；　ＤＮＡ甲基化　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４ｌ３Ｏ．２Ｏ１４．０５．０１４　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３　４１３０（２０ｌ４）０５—０５４０　０３　Ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＧＳＴＰ１　ｇｅｎｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｅａｒｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｒａｎ　Ｇｕｉｐｉｎｇ　，Ｙａｎｇ　Ｇｕｏｚｈｅｎ　，Ｆａｎｇ　Ｗｅｎ　，Ｙｕａｎ　Ｙｏｎｇ　，Ｚｈａｎｇ　Ｒｕｉａ＇ｉａ　（１．Ｆｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｂｒａｎｃｈ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｎｉｎｔｈ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１４１１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５０００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ＧＳＨ　ｓｕｌｐｈｕｒ—ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　Ｐｌ（ＧＳＴＰ１）ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｏｆ　ＨＣＣ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｎｉｎｅｔｙ　ｆｉｖｅ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　４０　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＨＣＣ，３０　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｌｉｖｅｒ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ａｎｄ　２５　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｐｈｙｓｉｃａ１　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＧＳＴＰ　１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅａｌ—－ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｓｐｅ——　ｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．　Ｆｈｅ　ｒｅｃｅｉｖｅｒ—ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）ｃｕｒｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ＨＣＣ．Ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＧＳＴＰ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｔｈｅ　ＲＯＣ　ｃｕｒｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧＳＴＰ１　ｇｅｎｅ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｄｉｓｔｉｎ　ｇｕｉｓｈ　ＨＣＣ　ａｎｄ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＡＵＣ一０．８６４１）．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　２　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏ—　ｓｉｎｇ　ＨＣＣ，ｉｔｓ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｗａｓ　８７．５　，ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　６９．６　；ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＧＳＴＰ１　ｇｅｎｅ　ｍｅｔｈｙ—　ｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ＡＦＰ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＨＣＣ　ｔｏ　７５　．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌ—　ａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｃａｎ　ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ　ｑｕａｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＧＳＴＰ１　ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ｃｅｒｔａｉｎ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｄｉ—　ａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＣ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ；　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　早期诊断是肝细胞癌（ＨＣＣ）获得早期治疗的前提，肝癌　有强大的代偿能力，早期常尢症状，这给肝癌的早期诊断带来　一１资料与方法　１．１一般资料　２０１２年１～１２月共收集贵阳医学院附院就　诊的９５例患者的血清标本。其中４０例ＨＣＣ（肝癌组）均为住　院病例，其中男件２９例，女性１１例，年龄３６～８２岁，中位年龄　５８岁，全部病例均经术后组织学诊断为ＨＣＣ；其中甲胎蛋白　（ＡＦＰ）≥４００／，ｇ／Ｉ　的２２例。３０例肝硬化组，其中男性１８例，　女性１２例，年龄３６－－７９岁，中位年龄６５岁。２５例健康对照组　定的困难，冈此，寻找外周血肿瘤标记足临床上亟须解决的　个难题。循环兀细胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）是存在于血清和血浆中　的游离ＤＮＡ，近年研究表明ｌｌ　，肿瘤在牛长过程中持续释放　一肿瘤细胞ＤＮＡ进入外周　液，因此，检测ＩＩＩ【清或血浆的肿瘤　特异性基冈改变，町反映肿瘤的存在和严重程度。谷胱甘肽一　硫一转移酶荩ＩＮ（ＧＳ７、Ｐ１）是重要的ＤＮＡ损伤修复基网，属抑　痛基因，ＧＳＴＰ１基因ＣｐＧ岛高度甲举化町能参与ｒ肝癌的发　生、发展ｌ　，因此检测肝癌患者血清或Ｊ０【浆中ＧＳ７　Ｐ１的甲基　化水平将有助于＿ｒｌ解肝癌的发生发展过程。本研究采用自行　建　的实时荧光ｌ１｛基化定黾方法检测了４Ｏ例ＨＣＣ患者外周　血血清巾ＧＳＴＰ１基冈启动子区的甲基化水平，探讨了其在　ＨＣＣ的早期诊断中的意义。　血清来自健康体检者，男性１５例，女性１Ｏ例，年龄３５～７２岁，　中位年龄６Ｏ岁。３组资料在年龄及性别一卜比较差异无统计学　意义（Ｐ＞０．０５）。患者采集静脉血５　ｍＩ　，离心后分离血清，以　每管８００　Ｉ　分装置１．２试剂２０℃保存。　ＧＳＴＰ１基　甲基化引物序列和非甲基化引物序　列（上海生工公司合成）、血液ＤＮＡ快速提取试剂盒由深圳亚　能生物技术有限公司提供，ＳｓｓＩ甲基转移酶购自美国ＮＥＢ　＊　基金项日：国家级教学团队资助项目（教高函［２００９］１８号）。　通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎｇｇｕｏｚｈｅｎ＠ｇｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ　作者简介：冉贵萍，女，副主任技师，主要从事肿瘤分子诊断研究。　△　国际检验医学杂志２０１４年３月第３５卷第５期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ　２０１４，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．５　・５４１・　公司。　１．３方法　饰ＤＮＡ的相对定量值对实验样品值进一步作归一化处理。　计算公式如下：ＰＭＲ一（ＧＥＮＥ…ｐ１　／ＲＥＦ…ｐ】　）／（ＧＥＮＥ　ＲＥＦ　ｓａｍｐｌｅ为样品；ｐｏｓｉｔｉｖｅ为甲基化　性对照ＤＮＡ。　／　）×１００　（ＧＥＮＥ为日的基冈；ＲＥＦ为内参基闪；　１．３，１　ＰＣＲ引物设计　根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ（ＡＹ３２４３８７）中人类　ＧＳＴＰ１基因序列设计扩增ＧＳＴＰ１基因启动子区序列，所设　计的甲基化特异引物、非甲基化特异引物序列和内参Ｇ—ａｃｔｉｎ　引物序列见表１。　表１　引物序列　１．４统计学处理全部资料用ＳＰＳＳ　１３．０软件分析，采用非　参数检验比较不同组问血清ＤＮＡ甲尽化水平的差异；采用　ＲＯＣ曲线评估血清ＧＳＴＰ１基因甲基化对ＨＣＣ的诊断价值，　以Ｐ％０．０５表示差异宵统计学意义，分析使Ｊ时ｊ绘制医学图表　进行。　２　结　果　２．１　ＭＳＰ对ＧＳＴＰ１基凶的定性检测　为了对所用引物和扩　增条件进行验证，首先对三组【Ｉ１＝Ｌ清ＤＮＡ样本进行ＭＳＰ扩增，　Ｍ：甲基化特异性引物；ｕ：非甲基化特异性引物。　１．３．２血清ＤＮＡ的抽提和纯化　血清ＤＮＡ的抽提采用微　量ＤＮＡ抽提试剂盒（深圳亚能公司），对其中的操作步骤适当　改良（按比例扩大每次处理的血浆黾，ＤＮＡ得率和纯度无影　响），每３００　Ｉ　血清获得７Ｏ　Ｉ　的ＤＮＡ，所有保存血清标本均　采用同一批号的试剂盒抽提ＤＮＡ以减少批问误差，并统一集　中检测。　１．３．３　甲基化特异　Ｉ￣－ＰＣＲ检测修饰过程：取已提取的血清　ＤＮＡ　１０／，Ｉ　，加入１．１　Ｉ　的ＮａＯＨ（３　ｔｏｏｌ／Ｉ　），于３７　Ｃ变　ｔＯ－１０　ｍｉｎ。加入１０　ｍｍｏｌ／Ｉ　对苯二酚６“Ｉ　，再加入１Ｏ４／，Ｉ　（ＰＨ　５．０）３　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨＳＯ。混匀，表面覆盖矿物油，避光，５Ｏ℃水浴　１６　ｈ进行甲基化修饰。水浴完毕后准备纯化ＤＮＡ，于室温下　加入４　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ至终浓度为０．３　ｍｏｌ／Ｉ　，放置１０　ｒａｉｎ，加　入１／ｌＯ体积的３　ｍｏｌ／Ｉ　乙酸钠和２倍体积的冰乙醇沉淀　ＤＮＡ，一２Ｏ℃放置过夜，第２天以７ｏ　的乙醇洗涤沉淀物，真　空干燥，加３Ｏ　Ｉ　ＴＥ（ｐＨ　８．０）溶解，一２Ｏ℃保存。ＰＣＲ反应　体系：亚硫酸氢钠处理的模板ＤＮＡ　５．０“Ｉ　，各引物（２０　ｇｍｏｌ／　Ｉ　）１．０　Ｉ　，１０　ｍｍｏｌ／Ｉ　ｄＮＴＰ　１．０／ａＩ　，１０×ｂｕｆｆｅｒ　５．０　Ｉ　，　ＴａｑＤＮＡ聚合酶２．５　Ｕ，加灭菌蒸馏水至５０／ｘＬ。反应条件为：　９５℃预变性１５　ｍｉｎ，继以９５℃（５Ｏ　ｓ），５７℃（１　ｍｉｎ），７２　Ｃ（１　ａｒｉｎ）共３５个循环，最后于７２℃延伸ｌ０　ｍｉｎ，以水为空白对照，　健康人白细胞基因组ＤＮＡ作阴性对照，以ＳｓｓＩ甲基转移酶体　外修饰的基因组ＤＮＡ为阳性对照，扩增产物以２　琼脂糖凝　胶电泳，凝胶成像仪观察结果并拍照。　１．３．４　ＭｅｔｈｙＩ　ｉｇｈｔ定量ＰＣＲ方法　ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ是建立在　Ｓｙｂｅｒ　ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光ＰＣＲ技术上的甲基化定量分析技术，　通过一对甲基化特异性引物（即表１中ＧＳＴＰ１一Ｍ引物）和荧　光染料Ｓｙｂｅｒ　ｇｒｅｅｎ　Ｉ对目的基因进行定量，同时以Ｂ　ａｃｔｉｎ基　因作为内参基因来校正样品间在模板量上的差异。定量ＰＣＲ　使用Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０荧光定量ＰＣＲ仪进行扩增，２Ｏ“Ｉ　反应体　系包含７．２　Ｉ　蒸馏水，１Ｏ　Ｉ　ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ，０．４　Ｉ　的一　游　引物和０．４　Ｉ　的下游引物，２　Ｉ　模板。扩增条件为９５℃变　性３０　Ｓ后，９５℃５　Ｓ，５７℃２５　ｓ，７２℃１０　Ｓ，循环４Ｏ次后进行　熔解曲线分析。每次检测设置阴性对照为健康人白细胞基因　组ＤＮＡ、阳性对照为ＳｓｓＩ甲基转移酶体外修饰的基因组　ＤＮＡ，使用甲基化百分比参数（ＰＭＲ）来描述血清ＤＮＡ的　ＧＳＴＰ１基因的甲基化水平；其计算过程是首先通过Ｂ—ａｃｔｉｎ内　参基因来对目的基因进行相对定量，然后再用甲基化酶体外修　结果如图１显示，ＧＳＴＰ１基冈的甲基化引物均扩增出９３　ｂｐ　大小的目的条带，非甲基化引物均扩增出９７　ｂｐ大小的目的条　带，扩增片段大小正确，阳性对照和阴性对照均扩增出相应条　带，ＭｓＰ的定性结果证实ｒ引物扩增的正确性。　Ｃａｓｅ］Ｃａｓｅ２——Ｃａｓｅ３Ｃａｓｅ４　——————．上　．　Ｕ　嫩　Ｕ敞　Ｌｊ敞　凇　Ｌｊ　ｕ：用ＧＳＴＰ１一Ｕ非特异性引物扩增；Ｍ：用ＧＳＴＰ１一Ｍ特异性引物　扩增。Ｃａｓｅｌ，２：部分甲基化ｍＬ清标本；Ｃａｓｅ３，４：完全甲基化血清标本；　Ｐ：阳性对照（Ｓｓｓｌ甲基转移酶体外修饰基因组ＤＮＡ）；Ｎ：阴性对照（健　康人白细胞基因组ＤＮＡ）。　图１　ＨＣＣ中ＧＳＴＰ１基因ＭＳＰ电泳图　２．２　ＧＳＴＰ１基因的Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ的相对定量分析见图２（见　《国际检验医学杂志》网站主贞“论文附件”）。ＧＳＴＰ１基因在　１Ｏ个肝痈血清样本荧光相对定黾的分析结果，蓝色柱表示　ＧＳＴＰ１／８一ａｃｔｉｎ的相对定量值，红色柱表示待测样本／甲基化　ｍ性对照的比值。以Ｓｓｓ　Ｉ甲丛转移酶体外修饰ＤＮＡ扩增值　作为甲基化阳性对照（０一ａｃｔｉｎ基因为内参），标准值为ｌ，各肝　癌患者血清样本ＧＳ７’Ｐ１基因甲基化水平可以以甲基化百分　率来进行定量。　２．３　ＧＳＴＰ１基冈的甲基化水平的定量分析　见图３（见《旧　际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。肝癌组中４Ｏ例患者　ＩＩＩＬ清的ＰＭＲ的中位值为０．１１７　２（四分位距０．０３４　２～　０．２８５　１），肝硬化组中３０例患者血清的ＰＭＲ的中位值为　０．０２７　４（四分位距０．０１３　１～０．０４５　３），２５例健康对照组的　ＰＭＲ的中位值为０．０１０　８（四分位距０．００６　２～０．０２８　６），其中　肝硬化组与健康对照组的ＧＳＴＰ１基　的甲基化水平比较差　异无统计学意义（Ｐ一０．２５７　９），而肝癌组的ＧＳ７、Ｐ１甲基化水　平明显高于肝硬化组和健康对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜　０．０５）。　２．４　ＲＯＣ曲线分析见图４（见《国际检验医学杂志》网站主　页“论文附件”），肝癌组与健康对照组的ＰＭＲ进行比较，　ＧＳＴＰ１基因的ＡＵＣ值（０．８６４　１）大于０．５，统计学表明　ＧＳＴＰ１基因甲基化水平可作为辅助诊断肝癌的指标（Ｐ＜　０．０５），以甲基化率２　作为诊断ＨＣＣ的临界值，其诊断特异　度为８７．５　，敏感度达６９．６　；肝癌组与肝硬化组的ＰＭＲ进　行比较，ＡＵＣ值为０．７７５，统计学表明町有效将肝癌和肝硬化　区分开，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），但敏感度较低　・５４２・　国际检验医学杂志２０１４年３月第３５卷第５期Ｉｎｔ　Ｊ　ＬａｂＭｅｄ，Ｍａｒｃｈ　２０１４，Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．５　（３９．８　）；　肝馊化　健康对Ｊ｛《｛组比较的ＡＵＣ值为　０．６５５　３，略高于０．５００　０，统计学比较　明不足以将两ｌ者区分　开（Ｐ一０．５８４　２）。　２．５联合检测　２００１年９月全旧肝痛学术会议确定将　ＡＦＰ≥４００　ｇ／１　作为ＨＣＣ临Ｊ未诊断的ｍ忡闽值　。在本研　究中２２例ＡＦＰ≥４００／￣ｇ／Ｉ　的ＨＣＣ患者巾，其甲幕化均为阳　，枉１８例ＡＦＰ￣４００／，ｇ／Ｉ　的ＨＣＣ患者中，有８例甲基化定　帚结果为　性，单独ＡＦＰ指标埘ＨＣＣ的榆出率为５５　（２２／　４０），而联合检测『ｆｆＬ清ＧＳ７、Ｐ１丛凶甲摹化与ｆｆＩＬ清ＡＦＰ可将　ＨＣＣ的检　率提高至７５　（３０／４０）。　３讨　论　循环ＤＮＡ足仔住于血清和血浆ｒｌ１的少量的游离ＤＮＡ，近　年来Ｈ益增多的研究表明，肿瘤存牛长过程中能持续释放肿瘤　细胞ＤＮＡ进入外周ｍ液，循环ＤＮＡ能维持和表达肿瘤细胞　来源的分子遗传特　，闪此通过检测血清ＤＮＡ的变化可以反　映肿瘤的仔　和严重秤度。　肿瘤患者ｍ清或血浆中肿瘤相关基凶改变如癌基因的突　变、染色体微Ｉ　星小稳定性、抑癌基凶的突变、基因杂合现象的　丢火等卜ｊ原发灶的改变相一致，为应用血清中ＤＮＡ甲基化作　为肿瘤标记检测和监测肿瘤的发牛、发展提供了令人鼓舞的口『　能。有科学家发现，血清异常甲基化总是与肿瘤组织甲基化同　时…现　］。Ｅｓｔｅｌｌｅｒ等［１　采用甲基化特异性ＰｅＲ法检测２２　例ＮＳＣＩ　Ｃ肿瘤抑制基Ｉ大１　Ｐ１　６（ＣＤＫＮ２）启动子甲基化、死亡相　关蛋门激酶（ＤＡＰ酶）、谷胱　肽ｓ转移酶Ｐ１和０６甲基鸟嘌　呤ＤＮＡ甲基化转移酶（ＭＧＭＴ），发现６８　（１　５／２２）ＮＳＣＩ　Ｃ肿　瘤组织中至少有１种以上　发生甲基化异常，而健康对照组　常肺组织尢类似变化，１　５例有甲基化的原发肿瘤中１１例　（７３　）ｍ清　也发现魑陶不正常　基化，所以，检测ＤＮＡ甲　基化的改变町以反映肿瘤巾特异性的核酸改变，冈此，建立一　种快速、简便的方法对ｍ清ｌｆ１　ＤＮＡ甲荩化定帚［１　］，将有助　于提高原发　肝癌０　期检测的ＨＩ　性率。　ＧＳＴＰ１基因是一晕要的Ｉ）ＮＡ损伤修复基　，属抑癌基　，其编码的蛋门ＧＳ　ＦＴｒ类酶属于体内Ⅱ相代谢解毒酶同＿ｒ　酶　家族，　保护机体细胞不受毒物和致癌物丛团的损害方面起着　重要作用。研究报道彳Ｆ人原发性肝痛Ｌ卜Ｉ具有高频牢的ＧＳＴＰ１　蛋广Ｉ表达缺失或降低，ｎ同时检测剑ＧＳＴＰＩ　【大ｊ启动子区　ＣｐＧ岛的高ｆ『　１化，　日Ｊｊ町能足由于其高　基化而表达下调，　进　促进ｒ　痛的发　发展。有研究　日』Ｊ＿５　，８８　的原发性月『　癌组织表ｌ达ＧＳ＂／　Ｐ１堪冈ＣｐＧ岛异常甲基化，少数健康组织ｒｒｌ　也可｝｛｛现异常【｝］丛化，但血清ＤＮＡ的高甲基化却只存在于纯　恶性疾病ｉｆｉ，闪此其特异性诊断价值受到　视。本研究通过　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｔ荧光定量法对肝痈、肝硬化及健康对照者血清　中ＧＳＴＰ１基　甲堆化水平进行定景，发现ＪＪ十癌组和健康对照　组的叶｛　化水平比较差异有统汁学意义（Ｐ％０．０５），由健康对　照组、肝硬化组到肝癌组ＧＳＪ、Ｐ１基凶的甲慕化定量水平总休　卜升趋势，进一步证实了ＧＳＴＰ１基因甲皋化参与ＨＣＣ的　发生发展过程，足ＨＣＣ形成巾的早期事件，可以作为ＨＣＣ早　期诊断的一项敏感指标。本研究通过Ｒｏｅ曲线评估了　ＧＳ７、Ｐ１　［｛｛基化水平　肝癌诊断卜的可行性，当以　化　率２　作为诊断ＨＣＣ的临界值时，其特异度为８７．５　，诊断敏　感度达６９．６　，具有…定的诊断价值。同前临床上原发性　癌常用的辅助诊断和监测的血清学指标是ＡＦＰ，然而ＡＦＰ的　灵敏度有限，ＡＦＰ诊断原发性肝癌的敏感度为４８　～６２　，特　异度为８１　～９８　…。本实验在血清ＡＦＰ≥４００　ｇ／ｉ　的２２　例患者【ｆＪ，其ＧＳ　Ｐ１基因甲皋化均阳性，在ＡＦＰ水平低于临　床诊断闽值（４００　ｇ／ｌ　）的１８例患者中有８例为　基化阳性，　可以看出血清ＤＮＡ甲　化检测比传统的ｍ清蛋白肿瘤标志　物的榆测更灵敏，更有利于肿瘤的早期诊断。冈此通过甲摹化　荧光定量法榆测肝癌患者血清中甲丛化水平具有提高ＨＣＣ　检出率的重要作用。　总之，Ｆ｝Ｉ　化荧光定量法操作简便，利于临床检测推广，可　对血清巾ＧＳＴＰ１荩冈的甲基化水平定量检测，对ＨＣＣ的早　期诊断、早期治疗和预后削断有一定价值，由于入组病例不多，　尚需扩大病例，开展前瞻性的研究，以伞　评估血清ＤＮＡ的　甲基化检测用于ＨＣＣ早期诊断、预后判断的价值。　参考文献　［１］Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ　Ｅ，Ｄａｖｉｌａｓ　Ｅ，Ｓｏｔｉｒｉｏｕ　Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌｌ　ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ａｓ　ａ　ｎｅｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ　ｆｏｒ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｎｃｅｒ　［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌ　Ｒｅｓ，２００４，１４（９）：４３９　４４５．　［２３邓立春，许晨，姜藻．恶性肿瘤患者循环血ＤＮＡ的研究进展［Ｊ］．　东南大学学报：医学版，２００７，２６（５）：３８２—３８５．　［３］Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｎ，Ｎａｋａｙａｍａ　Ｔ，Ｋａｊｉｔａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｅｒｒａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＳＴＰ１，ＲＡＳＳＦＩ　Ａ，ａｎｄ　ＲＡＲ　ｅ３２　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　ａ　ｎｅｗｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎｅ—　ｓｔｅｐ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰｅＲ　ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｒｅａｔ，　２０１２，１３２（１）：１６５　１７３．　Ｅ４］白同，杨斌，娄诚，等．ＡＰｅ和ＣＤＫＮ２Ａ基因甲基化定量分析对肝　细胞癌的诊断价值ＥＪ］．世界华人消化杂志，２００９，１　７（２９）：３００１　３００７．　Ｅ５３王锦红，覃扬，李波，等．ＨＣＣ患者ＧＳＴＰ１基因启动子区ＣｐＧ岛　甲基化状态研究［Ｊ］．四川Ｉ大学学报：医学版，２００５，３６（５）：６８６　６８８．　Ｅ６３上丰，华东，吴玉玉，等．血浆ＧＳＴＰ１和ＳＦＲＰ１基因甲基化分析　在肝细胞痛　期诊断中的价值［Ｊ］．中尉癌症杂志，２０１１，２１（１）：　１２—１　６．　［７］杨秉辉，夏景林．原发性肝癌的临床诊断与分期标准［Ｊ］．肝脏，　２００４，９（Ｓ１）：６７　６８．　Ｅ８］Ｃｈａｎｇ　Ｈ，Ｙｉ　Ｂ，Ｌｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ￣．Ｅｘｐ　Ｍｏｌ　Ｐａｔｈｏｌ，２００８，８５（２）：９６　１（）Ｏ．　［９］Ｌｏｆｔｏｎ—Ｄａｙ　Ｃ，Ｍｏｄｅｌ　Ｆ，Ｄｅｖｏｓ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｂｉｏｍａｒ　ｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｂｌｏｏｄ　ｂａｓｅｄ　ｅｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇＥＪ］．Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，　２００８，５４（２）：４１４　４２３．　ｒ１０３　Ｖａｎ　Ｄｅ　Ｖｏｏｒｄｅ　Ｉ　，Ｓｐｅｅｃｋａｅｒｔ　Ｒ，Ｖａｎ　Ｇｅｓｔｅｌ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｍｅｔｈ—　ｙｌａｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　［Ｊ］．Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ，２０１　２，７５ｌ（２）：３０４　３２５．　ｒｌ１］Ｅｓｔｅｌｉｅｒ　Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ　Ｃｅｓｐｅｄｅｓ　Ｍ，Ｒｏｓｅｌｌ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂ　ｅｒｒａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ＥＪ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９９，５９（１）：６７　７０．　ｒ　１　２３　Ｍａｌｅｎｔａｃｅｈｉ　Ｆ，Ｆｏｒｎｉ　Ｇ，Ｖｉｎｃｉ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｌｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐｒ。ｔ。ｃｏ１［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２００９，３７（１２）：ｅ８６．　［１３］Ｌｅ　Ｔ，Ｋｉｍ　ＫＰ，Ｆａｎ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｍｅｔｈ—　ｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏ—　ｃｈｅｍ，２０１１，４１　２（２）：２０３—２Ｏ９．　Ｅｌ４］Ｓｏｎｇ　Ｐ，Ｇａｏ　Ｊ，Ｉｎａｇａｋｉ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎ—　ｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎｄ　ｅａｒｌｙ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｉｎ　Ｊａｐａｎ　ａｎｄ　Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｉ．ｉｖｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ，２０ｌ３，２（１）：３卜３９．　（收稿日期：２Ｏ１３－１０—１０）